历届会议精彩回顾：微生物育种工程与应用评价研讨会自2012年起分别在石家庄、无锡、洛阳、福州、成都、芜湖、济南成功举办九届，已经成为生物育种领域享有盛名的学术研讨会之一。历届会议汇聚业界精英，精彩专家报告，代表热烈交流，为企业及技术人员和科研单位与科研人员之间搭建了深入沟通的桥梁，与会代表反响良好。往届会议现场盛况第八届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会第九届微生物育种工程与应用评价研讨会

       本期为您推荐华南理工大学食品科学与工程学院魏东教授团队发表在国际藻类学期刊《Algal Research》上的一篇文章：Rapid screening of high-protein Auxenochlorella pyrenoidosa mutant by an integrated system of atmospheric and room temperature plasma mutagenesis and high-throughput microbial microdroplet culture。本研究利用常压室温等离子体诱变（ARTP）和高通量微生物微滴培养的集成系统（MMC），快速筛选出高蛋白质的蛋白核小球藻突变株，为异养发酵生产替代蛋白质提供了有希望的候选菌。图1 蛋白核小球藻高蛋白突变株的选育流程       随着全球人口的增长，对食物的需求也在增加，这加剧了在耕地减少和对传统肉类生产的伦理担忧中寻找新蛋白质来源的需求。微藻作为一种有前途的替代蛋白质来源，富含蛋白质、氨基酸、多不饱和脂肪酸（PUFAs）、维生素和矿物质。然而，在异养培养条件下，由于光合作用依赖的蛋白质合成减少，微藻通常表现出较低的蛋白质含量（       研究人员前期利用ARTP诱变获得金黄色蛋白核小球藻A4-1为出发藻株，进行新一轮的ARTP诱变，辐照15秒后，转移至摇瓶培养。将处于对数生长期的细胞稀释至OD450nm值为0.6-0.8，转移至MMC系统进行进一步培养。       在MMC体系中，初始生成50个液滴，每一代运行时间在24-46小时，实时检测液滴在450 nm处的吸光值，表征藻株生长情况。经过三轮培养，筛选出长势好的液滴（第28号液滴）。整个实验流程仅耗时116小时，相较于传统平板体系有着较大的提升（图 2A）。将液滴进行单克隆分选，得到23株菌，选取其中4株（MMC-1、7、8和11）生长速率或者生物量浓度较高的进行后续的分析（图 2B）。图2 MMC中液滴的生长和单克隆微孔板培养的细胞生长       在250 mL摇瓶中培养的四个选定突变体（MMC-1、7、8、11）的细胞生长和生物量产量如图 3A所示。所有突变体的生长模式与A4-1藻株相似，均经历了初始滞后期，随后迅速进入指数生长期。MMC-7达到了最高的生物量浓度8.21 g/L，比A4-1菌株的7.57 g/L高出8.49%（p 图3 突变株与出发藻株A4-1在摇瓶中的细胞生长和色素组成       生化成分分析显示，在四个突变体中，蛋白质含量增加了12%至40%（图 4）。MMC-8突变体显示出了最高的蛋白质含量（63.26%干重）和低的淀粉含量（8.59%干重），比出发藻株A4-1分别增加了40.11%和减少了56.24%。此外，MMC-8在蛋白质质量上也表现出色，其氨基酸含量（44.35%干重）和评分（95）均高于A4-1。图4 突变株与出发藻株A4-1生化组成图5 系列突变株与出发藻株A4-1必需氨基酸指数与氨基酸组成       本研究展示了ARTP-MMC系统作为一种强大的高通量筛选平台的潜力，不仅提高了蛋白质的合成效率，还减少了淀粉含量，使得碳分配向蛋白质合成方向倾斜，对于提高生物蛋白质生产效率和可持续性具有重要意义。论文链接：https://doi.org/10.1016/j.algal.2024.103509

‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍一、背景介绍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍       肠道菌群数量庞大，构成复杂，人体肠道微生物群的组成和生理变化与多种疾病有关，通过研究肠道微生物能够更好地了解其与人类健康之间的关系，目前，针对此研究来说，肠道菌群的分离和培养工作至关重要。‍‍‍‍‍‍‍‍       传统的肠道菌群分离培养方式以平板模式为主，由于工作量较大，平板培养模式存在费时耗力、效率低下的问题，且往往培养效果不佳。‍‍液滴微流控技术‍‍在肠道菌群分离培养中的应用报道日益增加，其方法是将肠道菌群单分散至单个的独立液滴中，为单个菌种的生长提供了封闭独立的液体限域空间，极大地促进微生物生长，避免弱势菌株被生长优势菌株所覆盖，进而提高可培养微生物的种类及数量。‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍       本实验通过使用天木生物MISS cell仪器，全自动创建数万个独立的液滴培养单元，将微生物分散至各液滴中独立培养，不同种类的细菌个体可以在液滴中充分生长增殖，同时消除群落培养中过度生长及快速增长种群的影响。基于MISS cell设备的培养方法极大克服了传统平板培养方式的缺陷，为肠道共生菌稀有类群及厌氧环境菌群的鉴定和发现提供了重要研究平台。‍‍‍‍‍‍‍‍二、基于平板和MISS cell设备的肠道菌群分离培养实验过程1.样品预处理，确定上机浓度       收集粪便样本稀释后，使用血球计数板计数，用培养基将样品浓度稀释至10000-30000 CFU/mL，工作流程如下：2.通过MISS cell设备进行厌氧环境下肠道菌群的分离培养       本实验共生成约20000个液滴，经过37 ℃ 30天的厌氧培养后进行检测及分选，经过5小时的分选，共得到含菌液滴约4600个，并进行高通量测序，工作流程如下图所示：3.肠道菌群使用平板分离培养       本实验共涂布15个平板，经过37 ℃ 30天的厌氧培养后收集，并进行高通量测序，工作流程如下图所示：4.实验结果（1）与未培养粪便原液组相比，使用MISS cell 设备分离培养，多鉴定出10.9%（13/119）的细菌种类（属水平），显著优于平板的0.8%（1/119）。（2）液滴培养比平板培养物种丰富度提高40%（属水平），对于双歧杆菌属（Bifidobacterium）、嗜蛋白胨菌属（Peptoniphilus）、柯林斯菌属（Collinsella）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、肠球菌属（Enterococcus）、卟啉单胞菌属（Porphyromonas）等有较好的富集效果。三、天木生物MISS cell仪器为肠道菌群等严格厌氧菌的分离、培养和筛选过程提供高通量、高效的自动化解决方案       本研究中使用天木生物MISS cell仪器，共生成20000个液滴，分选得到单克隆液滴约4600个，实现肠道菌群的自动化培养和分选，同时，基于液滴培养的优势，避免了菌株之间的竞争性生长及交叉污染问题，显著提高了培养后富集的菌种丰富度。       MISS cell实现了肠道菌群实验全流程高通量、自动化操作，显著提升微生物培养能力，大幅降低实验人员工作量，提高工作效率，为包括肠道菌群在内的严格厌氧，提供了单克隆培养和高通量筛选的高效自动化实验平台，为菌株的培养和筛选提供强力支持！‍‍‍‍‍‍

       本期为您推荐广西科技大学生物与化学工程学院牛福星副教授课题组发表在Microbial Cell Factories上面的文章：Key role of K+ and Ca2+ in high-yield ethanol production by S. Cerevisiae from concentrated sugarcane molasses。本研究利用常压室温等离子体进行诱变，筛选出对不同胁迫因素（高渗透压、高醇、高温、高盐离子以及高浓度甘蔗糖蜜）分别具有鲁棒性能的酿酒酵母菌株。其中由此所选育的对高浓度甘蔗糖蜜具有鲁棒性能的酿酒酵母乙醇合成产量达到目前物理诱变高水平（111.65 g/L，糖醇转化率达到95.53%）。最后结合酵母的细胞形态、发酵产能以及组学分析，揭示了限制酿酒酵母无法实现高浓度甘蔗糖蜜高浓度乙醇发酵的主要限制性因素是K+和Ca2+同时存在的影响。       生物基乙醇的合成原料有很多，从环保、经济、富民的角度研发是重点。我国是人口大国，每年由于食品添加、工业应用等所消耗的糖量位居世界前列。甘蔗是糖分提炼的主要原材料之一，在提料糖分的同时会产生糖蜜，而且早期研究数据表明产3吨糖的同时可产约1吨糖蜜。糖蜜是一种混合物，成分复杂，直接排放或者用于田间施肥是为浪费且会造成环境污染，而且是为资源利用的不充分。但是利用糖蜜（非粮食）生物资源进行酿酒酵母的乙醇合成，却可以在不断满足人们对乙醇用量需求的同时，助推国家绿色低碳能源发展。酿酒酵母利用糖蜜进行乙醇发酵的工艺已经比较成熟，但是在利用高浓度的糖蜜来生产高浓度的乙醇效率方面却是一个挑战，究其原因便是各种胁迫性因素的影响。但是从科学研究的角度确切的阐述哪种才是限制性的关键影响因素早期还未有研究报道。       研究人员借助ARTP（室温等离子体）诱变、适应性进化以及高通量的基于三苯基-2H-四唑氯化铵（TTC）及前体物丙酮酸（或丙酮酸自由基离子）与Fe3+发生络合反应呈现黄色的双重高通量筛选方法（Py-Fe3+）获取了分别对高浓度甘蔗糖蜜（总糖浓度达到300 g/L）以及蔗糖添加模型下的高温（37℃）、高醇（10%）、高渗透压（400 g/L可发酵总糖）以及高浓度K+(15 g/L)、Ca2+(8 g/L)、K+&Ca2+(15 g/L &8 g/L)发酵环境下的七株鲁棒型酿酒酵母菌株（图1、表1）。通过各自鲁棒型菌株在高浓度甘蔗糖蜜环境下细胞形态比较（图2），乙醇合成的产率以及细胞数量（图3、图4）、鲁棒型菌株比较基因组学、比较转录组学GO、KEGG分析研究，得出K+、Ca2+同时存在才是限制酿酒酵母高浓度甘蔗糖蜜乙醇发酵的主要因素。图1 实验流程 表1 在相同发酵条件下与野生型J108相比产量差距图2 在250 g/L糖蜜发酵不同菌株的细胞形态A:NGCa2+-F1; B:NGK+-F1; C:NGK+&Ca2+-F1; D:NGTM-F1图3 不同菌株的乙醇合成率及细胞数图4.在5L发酵罐体系中利用250 g/L甘蔗糖蜜发酵， 菌株NGTM-F1的乙醇产量达到111.65 g/L       总结：甘蔗糖蜜对细胞的影响不仅仅局限于高浓度发酵，在低浓度情况下同样会对细胞的生长造成一定影响。该项目的研究是为初次从科学研究的角度准确阐述了限制酿酒酵母无法实现高浓度甘蔗糖蜜高浓度乙醇发酵的主要限制因素，其结果对于以甘蔗糖蜜作为底物的生物合成具有重要指导作用。文章链接：https://doi.org/10.1186/s12934-024-02401-5

研究背景：液滴微流控，作为近年来发展起来的一种高通量检测筛选技术，因其低成本，超高通量等优势，被广泛应用用酶定向进化、抗体开发、高产菌株筛选等领域。荧光激活的液滴分选是目前主流的微流控筛选方法，而多色荧光检测，为更加灵活的选择荧光标签，构建更加复杂的多参数荧光体系，提供了重要支持。本实验通过将绿色和红色荧光微球混合后进行液滴包裹，然后对液滴进行双激光同时激发和检测，获得微球在液滴内包裹状态的数据，从而验证DREM cell平台对多色荧光检测和筛选的功能适用性，为相关应用奠定基础。实验过程：1、样品处理：将绿色荧光微球（λex=488nm；λem=520nm；粒径5um）和红色荧光微球（λex=620nm；λem=680nm；粒径5um）浓度调整为5x10^6/ml；按照1：1的比例将两者混匀；2、使用液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）将上述样品包裹进微液滴，分别采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的荧光信号，对目标液滴群体圈门后，进行分选；DREM cell仪器的使用流程如下所示： 实验结果：1、分别采集520nm通道（PMT3）、670nm通道（PMT1）的信号，在两个通道的实时信号图中，能够对含有绿色荧光微球，含有红色微球，以及共包裹有红色荧光微球和绿色荧光微球的液滴进行识别和区分；2、在二维散点图中，分别对P1、P2、P3液滴群体进行圈门，分选，对收集到的液滴进行镜检观察，如下图：P1群体分选得到的为红色荧光微球，P2群体分选得到的为绿色荧光微球，P3群体分选得到的为共包裹红色荧光微球和绿色荧光微球的液滴，符合预期；实验结论：本实验利用天木生物开发的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell），对混合含有红色荧光微球的液滴、绿色荧光微球的液滴、以及共包裹两种微球的液滴进行了识别和区分，并根据双荧光检测通道的信号进行了圈门，成功对混合液滴中的三类液滴群体进行了筛选，表明了系统分选的准确性。应用展望：对于目标样品的多种不同荧光信号的同时检测和分析在高通量筛选研究中具有重要作用，如多功能酶进化研究、蛋白互作研究、免疫细胞筛选研究、多种荧光PCR研究，抗体筛选等，其中酶进化研究的典型案例如下图所示：该研究通过使用两种不同荧光标记的底物，实现了对布洛芬酯酶的立体选择性这一复杂性状的改造，经过五轮的突变和筛选，得到的最优突变体对S-布洛芬底物的选择性提升了700倍（DOI: 10.1038/s41467-018-03492-6

‍‍‍一、放线菌‍       放线菌（Actinomycetes）是一种原核生物类群，在自然界中分布很广，是一类极其重要的微生物资源，与人类的生产和生活关系极为密切，最突出的特性就是能产生大量的、种类繁多的抗生素。放线菌能形成分枝菌丝和分生孢子，呈菌丝状生长，主要通过形成无性孢子的方式进行繁殖，也可借菌体分裂片段繁殖。放线菌长到一定阶段，一部分气生菌丝形成孢子丝，孢子丝成熟便分化形成许多孢子，称为分生孢子。图1 放线菌模式图图2 放线菌的气生菌丝和孢子丝‍‍‍‍‍‍       由于孢子因其体积小、质轻、易飘散等特点，极易造成同一固体平板上的不同单克隆菌落间产生交叉污染问题，给放线菌的培养和分离带来了巨大挑战。       天木生物的高通量微升级液滴培养组学系统——MISS cell，可将细胞(孢子)包裹于液滴中，形成独立的培养单元，避免菌丝或孢子飞散至其它液滴单克隆内，从而克服菌株间的交叉污染问题，提高获得放线菌单克隆的效率和纯度。本实验基于菌丝体实现放线菌的分离与培养，为不产孢子的丝状菌的分离培养提供一种分离培养方法。‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍二、使用MISS cell分离培养放线菌1.样品预处理，确定上机浓度       收集放线菌菌丝体（30℃，培养4天），加入玻璃株打碎菌丝过滤，通过血球计数板计数，用BM培养基将样品浓度稀释至500-1000 CFU/mL，工作流程如下：图3 样本处理工作流程‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍2.MISS cell分离培养       本实验共生成2500个液滴，培养96h后进行检测及分选，经过60分钟的分选，共得到含菌液滴约500个，MISS cell仪器工作流程如下图所示。‍‍‍‍‍‍‍‍图4 MISS cell工作流程3.实验结果1) 生长速率对比：不同时间点观察液滴及平板放线菌生长情况，液滴培养1天后液滴中出现生长，平板培养6天后出现菌丝生长，液滴培养放线菌生长速率显著优于平板培养，放线菌的最佳培养分选时间为4天。‍‍图5 放线菌在固体平板上的生长情况图6 放线菌在液滴中的生长情况2) 放线菌液滴分选结果图图7 放线菌培养4天，在OD模式下的分选情况图8 放线菌培养4天，在荧光模式下的分选情况‍‍三、天木生物MISS cell仪器为放线菌的分离、培养和筛选过程提供高通量、高效自动化解决方案       本研究中使用天木生物的MISS cell仪器，共生成2500个液滴，分选得到单菌落约500个，实现放线菌自动化培养和分选，有效避免了菌株之间的交叉污染。同时，对于不产孢子的丝状菌也提供了一种分离培养方法。本次实验共计消耗培养基8ml，全程自动化实现液滴生成、培养和筛选至96孔板中，大幅提升单克隆获取效率，同时有效避免交叉污染问题，为放线菌的单克隆筛选提供了高效工具平台。       天木生物MISS cell仪器为包括放线菌在内含孢子的细菌，提供了单克隆培养和高通量筛选的高效自动化实验平台，为菌株的培养和筛选提供强力支持！

前言       补料工艺的优化是发酵工艺优化最重要的研究方向之一，持续而又稳定的补料速率往往对最终产物的合成和菌株的代谢方向影响较大。多数产物的合成在补料过程中需要严格将培养基中的糖控制在一定浓度。传统的控糖主要依靠操作人员不断地取样检测与手动调节补料速度，时效性较差，调控效果也较差。发酵工程师们也始终在寻找着更稳定，更精确的控糖方式。本案例以色氨酸生产菌株E. coli TM01为出发菌株，采用赛多利斯（7 L）平行生物反应器，分别通过手动控糖和生物培养过程在线检测仪（BODS）的自动检测控糖策略两种不同方式维持培养基中葡萄糖浓度，以色氨酸产量为指标来对比不同控糖模式的差异。图1 天木生物生物培养过程在线检测仪（BODS）实验过程       实验菌种：E. coli WT01。       种子液培养基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，葡萄糖20 g/L；       发酵液培养基：葡萄糖25 g/L，酵母提取物7 g/L，一水合柠檬酸1.1 g/L，硫酸铵7.5 g/L，磷酸二氢钾2 g/L，三水合磷酸氢二钾3 g/L，七水合硫酸镁1 g/L，七水合硫酸铁0.1 g/L，维生素B1 0.1g/L，甘油10 g/L，抗坏血酸 0.45 g/L，摇瓶发酵额外加入碳酸钙5 g/L；       发酵罐发酵培养：取甘油管中菌种活化后转接至种子培养液37℃培养12 h后，按5%接种量转接至发酵培养基。发酵过程在赛多利斯7L发酵罐中进行，通气量为1vvm，通过溶氧关联搅拌转速将溶氧控制在30%，通过流加氨水将pH维持在6.9。37℃培养至OD600到10左右后，降温至30℃并加入IPTG诱导。发酵过程中当培养基中的葡萄糖消耗完毕后，流加500 g/L的葡萄糖溶液将残糖浓度控制在 2 g/L。       手动补料组每1 h取样检测培养基中残糖浓度，并根据所测浓度手动调整补料策略。自动补料组使用天木生物的生物培养过程在线检测仪（BODS）实时检测培养基中残糖浓度，并由仪器自动调整补糖策略。发酵液中色氨酸浓度由液相进行检测对比。实验结果       如图2所示，在手动补料模式下，由于无法实时观察菌体的生长情况，培养基中残糖浓度波动较大，而且由于夜间操作人员疲劳，误差最大时甚至达到了+10 g/L的差异。残糖浓度的波动直接影响了菌体的生物量和色氨酸产量，手动控糖组色氨酸产量最高时仅有约0.3 g/L。而与之相比，BODS的智能关联补料完全摒弃了人为操作带来的误差，可以全天候实时监控发酵液中菌体的生长情况、检测培养基中残糖浓度（案例中设置为1 h自动取样并检测一次）并反馈给系统，然后根据设置值实时调整补料策略使糖稳定的维持在设定值（2±0.2g/L），更好的控糖策略也带来了色氨酸产量的大幅度增加，与手动补料模式相比，BODS智能关联补料模式下色氨酸产量提高了约71.4%。图2 手动补料和智能关联补料发酵结果对比结论       本案例以产色氨酸工程菌株为出发菌株，研究了不同补料策略下对菌株色氨酸产量的影响。实验结果证明：更稳定的控糖方式往往会带来产量大幅度的增加。与手动补料模式相对比，BODS智能关联系统在无操作人员的情况下通过自动取样检测、监控、反馈调节、自主学习补料策略等方式将培养基中残糖水平稳定的控制在了设定值（2±0.2g/L），也使菌株的色氨酸产量提高约71.4%，这说明了BODS在发酵工艺优化中的重要作用。除此之外，在工业化生产中残糖浓度的控制也是直接影响企业产品质量的关键参数，BODS的实时检测能力也有助于生产车间人员实时掌控发酵过程变化，及时调整工艺参数，帮助企业更好的完成产物的放大生产。       自成立伊始，天木生物恪守客户至上的原则，致力于提供高度专业化的菌种优化方案，为发酵过程优化提供更多可靠选择。

前言       微生物个体微小、构造简单、进化地位低、分布区域广，在不同的生存环境进化形成了各具特色的生态系统。土壤微生物的群落结构特征的相关分析对从土壤微生态方面降低作物种植成本、提高品质具有重要实践意义。同时复杂的生存环境为土壤微生物带来了丰富的生物多样性和独特的生化机制以及代谢途径，使其在新型生物活性物质的生产方面拥有着巨大的潜力。       但从复杂的土壤微生物菌群中筛选出合适的菌株始终是一个工作量比较大的任务。传统方法筛选菌种的一般步骤为：菌种采集→富集培养→纯种分离→性能测定→菌种保藏，该方法步骤繁琐、耗时较久，需要投入巨大的工作量和重复劳动。因此为了增加筛选效率，科研人员不断的去构建新型的筛选理论和自动化设备，诸多方法也已经成功的被应用在了土壤微生物的筛选领域，如变性梯度凝胶电泳法、实时荧光定量 PCR和微阵列等。       天木生物高通量微升级液滴培养组学系统（single cell microliter-droplet culture omics system, MISS cell culture omics）是基于液滴微流控技术开发的微型化高通量单细胞培养及分选装备，可以实现对环境菌群在单细胞水平上进行分离培养，液滴生成后存储于高透气性管路中进行孵育，最后通过光学信号（OD、荧光、化学发光等）进行检测分选，分选后的液滴进入多孔板中，用于后续实验。实验过程       本案例使用天木生物高通量微升级液滴培养组学系统作为基础构建了土壤微生物的高效筛选模型。       本次实验样本为野外土壤，称取2g样品，加入5倍体积的生理盐水和玻璃珠，4℃过夜震荡。静置沉降后取上清，用血球板计数，根据上清中菌含量稀释成3个浓度梯度（样品A，B，C），上机生成液滴，室温培养。同时按照MISS cell上样浓度的5倍分别制成样品D、E、F，涂平板，室温培养并统计菌落数。液滴盘培养15-45天，从60882个液滴分选出带菌液滴5628个，同时涂布平板共88个，统计菌落数共761个。测序结果显示：原始土壤中共检测出1264种菌，液滴体系中共检测出86种菌，平板体系共检测出73种菌（图2）。其中液滴中鉴定出50多种未能在平板中获得的菌株，包括布鲁氏菌、缺陷短波单胞菌等7大类的菌只在液滴中富集。同时由于液滴是单细胞包裹后培养，收集液滴中超过95%是可以进行鉴定后保藏。结论       本案例以OD阈值作为筛选依据，对土壤中的多种微生物进行了有效分离，并成功检测出了86株不同的微生物，比传统方法筛选种类高了17.8%，同时大大降低人工成本。该方法证明了微流控筛选系统在土壤微生物分离中的有效性。图1 土壤微生物筛选实验流程图2 原始土样、液滴和平板富集的细菌测序结果图3 原始土样、液滴和平板富集的细菌种类差异

       本期为您推荐江南大学未来食品科学中心副主任周景文教授团队发表在Synthetic and Systems Biotechnology上面的一篇文章：Synergetic engineering of Escherichia coli for efficient production of L-tyrosine。本研究通过协同工程策略，针对莽草酸途径并微调代谢过程，并利用实验室适应性进化（MMC）提高菌株对酸性条件的耐受性，最终获得了一株优化的菌株，在5升发酵罐中62小时内能够产生92.5 g/L的L-酪氨酸，对L-酪氨酸的工业化生产有着重要的意义。       L-酪氨酸在食品、饲料、化工和制药行业中具有广泛的应用，它不仅是多种天然产物的前体，如咖啡酸、类黄酮和姜黄素等，还涉及治疗帕金森综合症的药物L-DOPA的合成。尽管L-酪氨酸具有重要的工业价值，传统化学合成或者酶促法生产酪氨酸的工艺存在成本高和稳定性差的缺点。微生物发酵法产酪氨酸具有成本低，操作简单等优势，但是也存在产量较低，高密度发酵菌株不够稳定等缺点。       研究人员以大肠杆菌WSH-Z06作为起始菌株，对莽草酸和芳香氨基酸积累相关的几个基因进行过表达和敲除混合验证，得到一株联合4个基因过表达与3个基因敲除的菌株，48 h摇瓶L-酪氨酸产量达到4.22 g/L（图2 ）。接着在其莽草酸途径中添加磷酸解酮酶途径（PK），发现菌株在摇瓶中的OD600提升了9.8%，但是整体的L-酪氨酸产量呈现降低趋势。整合2个NADH与NADPH互相转化的基因后，得到的菌株产量提升至6.17g/L（图3a）。将该菌株进行5L发酵罐水平的发酵，L-酪氨酸的产量达到50.2 g/L，同时在发酵液中检测到12.4 g/L的乙酸（图3b），高浓度乙酸导致了菌体生长被明显抑制（图3b）。       为了减少乙酸的累积，对大肠杆菌乙酸生产途径基因进行敲除，得到的菌株乙酸产量下降33.6%，菌体生长略有改善。进一步提升其对乙酸的耐受性，提高赖氨酸产率，利用MMC（微生物液滴连续传代进化仪）进行适应性进化，在液滴体系下对超过200个液滴进行50次传代筛选，不断提高乙酸浓度，得到在pH 5.1下生长良好的菌株，最优摇瓶水平产量为7.11 g/L（图4）。通过在5L发酵罐中控制葡萄糖浓度与溶氧，最终L-酪氨酸产量达到92.8 g/L。       这一系列综合的工程策略显著推进了L-酪氨酸在微生物合成中的产量，为工业级生产提供了有力的实验支持。图1 葡萄糖生物合成L-酪氨酸途径图2 敲除和过量表达基因后赖氨酸的产量图3 优化菌株摇瓶与5L发酵罐发酵结果图4 大肠杆菌乙酸体系改性及耐酸性进化文章链接：https://doi.org/10.1016/j.synbio.2023.10.005 

融合科技与传统，引领发酵工艺新时代       本期为您推荐中国科学院天津工业生物技术研究所智能生物制造平台夏建业老师发表在生物工程学报上面的一篇综述：“人工智能时代发酵优化与放大技术的机遇与挑战”。文章描述了合成生物时代对发酵优化技术的挑战，结合人工智能在新时代的发展，对未来工业发酵优化技术的场景以及未来发酵技术对人才培养等提出的新要求进行了展望。       生物制造是利用生物体机能进行物质加工与合成的绿色生产方式，而发酵优化与放大技术是生物制造技术中决定实验室创新成果向产业化转化能否成功的关键一环。自2015年起，国务院发布《中国制造 2025》、《“十四五”智能制造发展规划》、《“十四五”生物经济发展规划》等相关文件，对企业实现数字化，自动化，智能化以及构建绿色低碳循环经济体系，推动生物经济实现高质量发展具有十分重要的意义。       我国传统发酵产业历史悠久，高性能的菌株和发酵工艺优化是推动其进步的基础。近年来高速发展的合成生物学技术使得高性能菌株的获得速度越来越快，与之相比，繁琐的工艺优化过程却始终是产业化的重要制约因素。如图1所示，反应器中进行的发酵过程涉及人为操作的操作参数(operation variables)、反应器层面的状态参数(state variables)以及细胞层面的生理特性参数(physiological variables)。然而由于发酵过程中存在复杂的物理化学过程，很难准确地获取这些参数之间的定量关系。因此如何通过相关技术手段将培养环境与菌体代谢特性的关系摸索清楚始终是发酵产业备受关注的问题。       传感技术是发酵过程优化中必不可少的关键技术，可以实时监测反应器中的生化反应情况，判断代谢是否正常（如发酵尾气分析技术和在线光谱检测技术）是。而微型反应器系统则是发酵过程优化中另一个关键技术。近年来利用人工智能技术和海量发酵过程数据开发出的微型平行反应器系统极大的提高了菌种验证和工艺开发的工业化进程。       Biofoundry平台等高通量自动化装备能实现每天千万株筛选水平，但配套的自动化发酵培养装备相对滞后。尽管国外相关公司在微型化、自动化、集群化方向上取得了一定进展，但高昂的售价和一次性反应器的成本限制了其在发酵工业中的广泛应用。国内方面，天木生物科技有限公司等一批高科技公司也始终在不断探索出路，其开发的在线自动取样装置在国内多家科研院所、生产企业获得成功应用。       装备技术的飞速发展，正推动传统发酵过程朝向生物制造的大数据时代发展，数据量的激增提升人们对发酵过程认识水平的同时也为高效数据处理提出了新的挑战。如何将配套的数据可视化以及基于人工智能技术的发酵过程自动化是行业发展的大势所趋，也将为传统发酵技术带来颠覆性的推动力。图1 发酵过程中操作参数、状态参数及菌体生理特性参数之间的关系示意图图2 多源异质数据融合对接技术框架文献网址：DOI: 10.13345/j.cjb.220606

时序更替，岁物丰成。万物向新，乘势而行。回望2023，破浪前行，坚定不渝；展望2024，百舸争流，奋楫扬帆。2024年1月30日，在热烈的氛围中，天木生物在宜兴举办了一年一度的年会盛宴。2024年，龙行龘龘，前程朤朤岁月流金，共聚欢愉。天木人相聚一堂，豪情欢歌辞旧岁，喜气开篇迎新年！    天木人个个“深藏绝技”，多才多艺，歌舞、相声、反串、舞台剧、诗朗诵等各类节目精彩纷呈，令人时而拍手叫好，时而捧腹大笑，而最激动人心的抽奖环节更是将年会气氛推向高潮，尖叫和欢呼声贯穿全场。岁序常易，华章日新；律回春渐，新元肇启。2024，天木人将坚守初心，砥砺前行；2024，天木人将乘风驭海，踏浪而升！ 天木生物祝您新春快乐！

由中国藻业协会和华东理工大学主办的中国藻业协会微藻分会第九届产学研大会将于2023年11月17日—20日在云南保山举办。本届会议以“以绿色创新推进新时代微藻产业高质量发展”为主题，探讨在国家绿色发展战略指引下，如何更好地推动微藻产业创新发展，寻求我国微藻产业高质量蓬勃发展的创新路径，以促进微藻产业的科技创新、产业升级和国际合作，推动我国微藻产业的技术水平和规模引领全球，为实现生态友好型经济，助力美丽中国建设贡献积极力量。天木生物受邀参加此次会议，将携高通量生物育种及筛选技术和装备出席亮相。 会议时间2023年11月17日—20日会议地点云南省保山市永昌大酒店天木展位6号 关于天木天木生物聚焦高通量生物育种及筛选技术和装备的开发与产业化，以自主开发的生物技术助力生物制造产业发展。相继开发了等离子体诱变育种仪、单细胞微液滴培养及筛选仪、微液滴连续传代培养进化仪和生化在线检测仪等四大类十余款产品，依托智能化、高通量细胞工厂创制平台，解决了细胞筛选效率低、过程及表型数据获取困难等“卡脖子”问题。立足微藻产业，天木产品从出发藻株的非理性诱变、优良藻株的高通量筛选到提高微藻细胞鲁棒性以及优化发酵工艺，以核心藻种的快速选育为微藻产业高质量提供助力。

       本期为您推荐清华大学合成与系统生物学中心主任陈国强教授团队发表在Metabolic Engineering 上的一篇文章：Engineering low-salt growth Halomonas Bluephagenesis for cost-effective bioproduction combined with adaptive evolution 。 本研究采用常压室温等离子体技术(ARTP)，对蓝晶盐单胞菌进行随机突变，筛选得到在低盐浓度下生长良好的菌株。对获得的优势菌株进行发酵生产PHA，实现了高产与成本降低的双重增益。对比突变菌株与野生型基因型，揭示了嗜盐宿主菌株的盐胁迫相关基因。       聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是细菌中用于能量储存的聚合物，可开发为绿色生物降解型塑料。其具备化工塑料的物化特性，但又有生物可降解性、生物相容性、光学活性、气体相隔性等一系列独特性质。PHA生产菌株嗜盐性单胞菌TD01是从中国新疆艾丁格尔湖分离的一种嗜盐菌，在高pH和高盐浓度下可在非无菌条件下快速生长。尽管现在已经在如表达载体与启动子等方面对蓝晶盐单胞菌进行改造得到高性能菌株，但是在其耐盐调节方面仍存在许多未知。而对蓝晶盐单胞菌的逆向改造如低盐、高pH存活，可以进一步降低盐废水处理成本、更高的细胞分离度和更高的PHA纯化度。       而由于细胞体内参与生物过程控制的细胞蛋白通常表现出不同的分配策略，以应对外部压力，如盐度的渗透压，热休克、紫外线照射等，对代谢网络的理性设计以获得盐胁迫的调节就存在了一定的难度。常压室温等离子体技术（ARTP）是一种全基因组随机突变方法，由于微生物耐盐性的机制涉及系统级调控网络，因此能够实现全基因组随机突变的ARTP更适合于蓝晶盐单胞菌的底盘改造。       研究人员以野生单胞菌TD01及3个重组菌TDH4，TD68，TD68-194为出发菌株，分别验证其在高浓度（50g/L NaCl）和低浓度（10g/L NaCl）盐环境下的生长状况，结果显示所有菌株在低盐浓度的平板中均未出现菌落（图2）。对这4株菌进行ARTP诱变，诱变时间5分钟，致死率曲线显示最佳处理时间为3分钟（图2）。在诱变后的库中筛选出4株在低盐浓度情况下生长最迅速的菌，进行第二轮诱变，最后得到4株菌：TD01A2B5, TDH4A1B5, TD68A2B3 and TD68-194A1B5（图2）。 其中TDH4A1B5菌具有最优良生产性能，细胞干重可以达到11g/L，含有60%质量百分比的PHA产量。       对突变菌株TDH4A1B5进行基因水平的改造，加入phaCAB操纵子，增强代谢通量，在7L体系中进行的40小时未灭菌补料分批发酵，相较于野生型的PHB和P34HB产量分别增加了21%和36%（图3）。进一步对其进行改造使得苏氨酸分泌率和外泌素分泌率分别提高了50%和77%，多方面的解析显示了其低盐浓度底盘菌的应用潜力（图4）。通过基因比对，揭示了嗜盐宿主菌株的盐胁迫调控机制，包括101个与渗透压相关的基因。更重要的是，通过使用重组嗜蓝菌TDH4A1B5，在7L发酵体系下的PHA的成本降低了1/3，这显著提高了其经济竞争力（图5）。图1 本文技术路线图图2 ARTP诱变数据图3 对H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造来高产PHA图4 对H. bluephagenesis TDH4A1B5的改造应用于多种蛋白的生产图5 低盐发酵与高盐发酵的成本分析论文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2023.08.001

         为加快推动我国生物制造技术创新及产业国际化发展，值“一带一路”倡议提出十周年之际，中国科学院天津工业生物技术研究所和国家合成生物技术创新中心联合“一带一路”国际科学组织联盟（ANSO）、南方科技促进可持续发展委员会（COMSATS）在科学技术部等有关部门的指导支持下，拟于2023年11月9日-10日在天津举办“生物制造产业创新发展国际论坛”。         论坛以“共享前沿生物科技成果 助推全球生物经济繁荣”为主题，通过汇聚“一带一路”共建国家等全球政产学研金用各界嘉宾，以学术交流、产业对接、展览展示等形式，为促进全球生物制造产学研合作和推动构建人类命运共同体发挥积极作用。天木生物受邀参加此次会议，将携高通量生物育种及筛选技术和装备出席亮相。   会议地点会议地点：天津滨海圣光皇冠假日酒店（天津空港经济区中心大道55号）会议日期2023年11月8-10日（11月8日报道）天木展位B06 公司简介         天木生物聚焦高通量生物育种及筛选技术和装备的开发与产业化，以自主开发的生物技术助力生物制造产业发展。相继开发了等离子体诱变育种仪、单细胞微液滴培养及筛选仪、微液滴连续传代培养进化仪和生化在线检测仪等四大类十余款产品，相关设备解决了细胞筛选效率低、过程及表型数据获取困难等“卡脖子”问题，依托智能化、高通量细胞工厂创制平台，从出发菌株的非理性诱变、优良菌株的高通量筛选到提高细胞鲁棒性以及优化发酵工艺，通过核心菌种的快速选育为生物制造按下加速键。 天木产品

会议邀请函|天木生物与您相约第四届生物设计研究大会暨现代生物技术发展与应用国际学术研讨会第四届生物设计研究大会暨现代生物技术发展与应用国际学术研讨会旨在展示合成生物学与现代生物技术领域的最新成果和研究进展，会议将以大会报告、特邀报告、青年论坛、研究生海报、圆桌讨论等多种形式开展，以期促进现代生物技术、生物系统设计与合成生物学等相关领域的国内外专家之间的交流与合作。天木生物受邀参加此次会议，将携高通量生物育种及筛选技术和装备出席亮相。会议时间2023年10月27日-10月30日会议地点湖北武汉楚天粤海国际大酒店天木生物展位号03天木生物以自主开发的新技术为合成生物学提供一站式解决方案天木生物聚焦高通量生物育种及筛选技术和装备的开发与产业化，以现代生物技术助力合成生物学产业发展。相继开发了等离子体诱变育种仪、单细胞微液滴培养及筛选仪、微液滴连续传代培养进化仪和生化在线检测仪等四大类十余款产品，相关设备解决了细胞筛选效率低、过程及表型数据获取困难等“卡脖子”问题，依托智能化、高通量细胞工厂创制平台，从出发菌株的非理性诱变、优良菌株的高通量筛选到提高细胞鲁棒性以及优化发酵工艺，为合成生物学提供一站式解决方案。天木产品

天木生物ARTP成功助力叶绿素缺陷型小球藻的选育本期为您推荐华南理工大学魏东教授团队发表在Bioresource Technology上的一篇文章：Breeding a novel chlorophyll-deficient mutant of Auxenochlorella pyrenoidosa for high-quality protein production by atmospheric room temperature plasma mutagenesis。本研究采用常压室温等离子体诱变技术(ARTP)，以蛋白核小球藻为原始菌株，通过多轮ARTP诱变和筛选，培育出蛋白质含量、质量和产量较高的叶绿素缺乏突变体，这样的微藻在生产未来食品蛋白的方面具有应用潜力。近年来，随着更多的人关注环境保护与健康饮食，人们开始寻找除动物肉以外的替代蛋白质。其中，微藻被认为是一种可替代的蛋白质来源，特别是螺旋藻和小球藻相较于传统蛋白质如肉、蛋、大豆、牛奶，有着更高的蛋白质含量。除此之外，微藻还含有多种营养物质，如多糖、多不饱和脂肪酸和维生素。此外，它们的生长周期短，不会与传统作物争夺水和空间。尽管微藻具有很多优势，但是由于他们颜色以及令人不舒服的气味，目前它们的使用仅限于含有微藻粉的健康食品。这是因为微藻内叶绿素含量高，具有强烈的绿色和青草味，尤其是像小球藻这样的绿色微藻。因此，有必要通过减少或去除叶绿素来改变不利的感官特性，以增加其作为新蛋白质来源的接受度。目前随机诱变技术在降低不同微藻中叶绿素含量应用广泛，但是化学诱变对操作者和环境都造成了严重的安全问题。而大气室温等离子体（ARTP）诱变产生的活性颗粒可以穿透细胞壁和膜，可以有效地对DNA造成多种损伤，导致突变率增加，不会产生有毒有害物质，与传统的紫外线辐射或化学诱变剂相比，成本低，环境友好。研究人员首先对野生菌株进行第一轮诱变，并在约22000个诱变库中筛选得到4株在琼脂平板上光照培养显示浅绿色或黄色的菌株。进一步摇瓶培养分析，结果表明，所有突变体的叶绿素含量均低于野生型（图2），与此同时所有菌株的生物量未表现出显著的差异。对最优突变体A4与野生型进行葡萄糖与硝酸盐浓度进行优化，最适初始浓度为30 g/L葡萄糖和3.75 g/L硝酸盐（图3）。以A4为出发菌株，对其进行了第二轮ARTP诱变，从16个优势菌株中挑选出5个生长性能较好的菌株，其中最佳突变体A4-1具有预期黄色外观和较高生物量浓度（图4）。通过比较WT与A4和A4-1突变体的生化组成，表明A4-1突变体具有黄色表征、更快的生长速度和更高的蛋白质含量，在感官属性和营养价值方面表现出了极大的改善。对优势菌株产生的蛋白质进行氨基酸分析，结果显示，ARTP诱变可以提高支链氨基酸的营养价值，增强Met和Cys的合成，同时蛋白质的质量也超过世卫组织制定的人体营养需求。对突变体代谢产物谱分析表明，ARTP突变可能改变了叶绿素合成中多种关键酶的表达，同时增强了氨基酸碳骨架从头合成，导致突变体中的蛋白质含量更高（图5，6）。本项研究为克服小球藻生物质作为未来食品替代蛋白质来源的应用瓶颈提供了一种很有前途的方法。图1 本文实验流程图2  不同菌株的叶绿素含量以及生物量图3 不同葡萄糖和硝酸盐攻读生物量和蛋白质生产的水平图4 WT，A4和第二轮诱变中突变体的细胞生长、生物量生产和生化成分图5 野生型和最佳突变体A4-1代谢产物谱的比较分析图6 WT和A4-1突变体代谢谱的比较分析论文链接：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.129907

       在中国化工学会化学工程专委会与生物化工专委会联合指导下，由北京化工大学、清华大学、中国科学院过程工程研究所联合主办的“2023年第七届全国化学工程与生物化工年会”将于2023年7月28日-30日在北京召开。           天木生物聚焦高通量生物育种及筛选技术和装备的开发与产业化。相继开发了等离子体诱变育种仪、单细胞微液滴培养及筛选仪、微液滴连续传代培养进化仪和生化在线检测仪等四大类十余款产品，相关设备解决了细胞筛选效率低、过程及表型数据获取困难等“卡脖子”问题，各产品性能均达高水平，相关仪器组成智能化、高通量细胞工厂创制平台，大幅度提高了筛选及育种工作效率。

 天木生物 聚焦高通量生物育种及筛选技术和装备的开发与产业化。相继开发了等离子体诱变育种仪、单细胞微液滴培养及筛选仪、微液滴连续传代培养进化仪和生化在线检测仪等四大类十余款产品，相关设备解决了细胞筛选效率低、过程及表型数据获取困难等“卡脖子”问题，各产品性能均达国际领先水平，相关仪器组成智能化、高通量细胞工厂创制平台，大幅度提高了筛选及育种工作效率。    常压室温等离子体诱变育种仪ARTPARTP技术是一种全新的、高效的生物诱变技术。该技术采用基于高纯氦气的射频辉光放电技术，所产生的等离子体射流活性粒子能量较高，可以诱发更丰富的基因突变。该技术被广泛的应用于各类微生物、植物和动物等的种质选育中，成功案例达上千个。微流控细胞培养、进化及分选系统液滴微流控技术是近年来备受关注的新兴技术，其具有体系小、传质效率高、自动化程度高和通量大等突出优点。相比于传统孔板筛选体系，该系统筛选速率提高10^4-5倍，试剂消耗量下降至10^6-7。该类仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等单细胞的分选，而且可以用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选中。微生物发酵在线检测系统该仪器具有取样体积小、多参数检测、全自动、时效性高等特点，可避免因取样体积过多影响整个发酵系统，同时多参数检测，可实时显示罐内生物量、底物消耗和产物生成情况，也可及时调节反馈控制系统，实现底物的精确控制流加等，提高发酵过程控制效率，为发酵过程优化和工艺放大提供数据支撑。

    本期为您推荐广西大学刘小玲教授研究团队发表在《食品工业科技》上的一篇文章：高产抗菌脂肽 Fengycin 芽孢杆菌的诱变育种和发酵条件优化。该研究以枯草芽孢杆菌 YA-215 为出发菌，通过复合诱变（紫外诱变、ARTP-LiCl 诱变）育种来获取高产 Fengycin 突变体，并优化发酵工艺，突变株暹罗芽孢杆菌 UA-397 的 Fengycin 产量为 517.09 mg/L[1]。文章摘要内容如下：      Fengycin 是一种由芽孢杆菌产生的环状脂肽分子，同时具有亲水性和亲脂性，这也导致其具有出色的生物表面活性剂活性和多种生物活性，亦具有抗菌范围广、安全降解性高和溶血性低等特点，在食品、医药和生物防治等方面拥有广阔的应用前景。Fengycin 的低产量和昂贵的生产成本，是其进一步商业化和产业化的瓶颈。紫外诱变、常压室温等离子体（ARTP）诱变、化学诱变是用于提高微生物脂肽类次级代谢产物产量简单且经济有效的方法。      为了提高 Fengycin 产量，以枯草芽孢杆菌 YA-215 为出发菌，通过复合诱变（紫外诱变、ARTP-LiCl 诱变）育种来获取高产 Fengycin 突变体。通过单因素实验和响应面试验等确定最佳发酵工艺优化。结果表明：复合诱变选育获得一株高产 Fengycin 突变株 UA397，全基因组测序结合 16 S 进化样本分析显示为暹罗芽孢杆菌。其最佳发酵工艺条件为：蔗糖25 g/L、蛋白胨 30 g/L、发酵温度 37.7 ℃、发酵时间 37.8 h、接种量 5.01%。在此发酵条件下，暹罗芽孢杆菌 UA-397 的 Fengycin 产量为 517.09 mg/L，是野生型在未进行发酵条件优化时 Fengycin 产量 113.02 mg/L 的 4.575 倍。研究结果为抗菌脂肽 Fengycin 应用于食品、医药和生物防治等领域奠定了产量基础。文章精彩内容如下：[1]陈尚里,于福田,沈圆圆等.高产抗菌脂肽Fengycin芽孢杆菌的诱变育种和发酵条件优化[J/OL].食品工业科技:1-16[2023-06-21].

为助力国产科学仪器发展，筛选和扶持一批优秀的科学仪器产品和企业，在中国仪器仪表行业协会、中国仪器仪表学会、北京科学仪器装备协作服务中心等单位的支持下，由仪器信息网主办、我要测网协办的“国产科学仪器腾飞行动”于2013年9月5日正式启动。秉承“国产科学仪器腾飞行动”宗旨，仪器信息网于2018年启动“国产科学仪器腾飞行动”之“创新100”项目，通过筛选一批具备自主创新能力的中小仪器厂商，借助报道、走访、调研等方式，在企业发展的关键时期“帮一把”。本期“创新100”访谈，仪器信息网走进无锡源清天木生物科技有限公司（简称“天木生物”），带大家了解这家聚焦生物育种技术与装备开发的高新技术企业。仪器信息网：请介绍一下天木生物的发展历程，公司创立的初衷和定位是什么？天木生物：天木生物于2014年在清华无锡研究院创立，聚焦高端科研仪器开发。前五年主要沉下心来从事技术积累和产品开发，经过不断地积累，天木生物于2020年逐渐迎来了产品爆发。从最初的一款产品，到现在发展成十余款产品、20多个型号，并形成了等离子体生物技术、液滴微流控技术、生物样品自动化处理与检测技术等三大核心技术体系，产品线应用场景也从单一的工业微生物，拓展到生物医药、农业等领域。天木生物秉承“顶天、立地”的发展理念，以产业实际需求为导向，做创新、实用的产品，以提升中国生物产业的育种能力为己任，打造中国育种行业的发动机。面向高通量生物育种及筛选和装备的开发与产业化，天木生物相继开发了等离子体诱变育种仪、微流控细胞培养、进化及分选系统和微生物发酵检测系统等，相关产品组成智能化高通量细胞工厂创制平台，大幅度提高了筛选及育种工作效率。仪器信息网：请介绍一下天木生物当前的规模概况？天木生物：现阶段，天木生物正处于发展初期，公司近三年研发投入金额占总营收比例达50%，研发人员数量占总人数的65%，并借助国家重大项目资金、投融资等，确保各项产品研发的顺利进行。经过8年的研发和积累，天木正生物已培育出一整套成体系的生物育种及高通量技术与设备，且与清华大学、安徽工程大学、中国农业大学、天津工程研究所等百余家高校和科研机构，以及各类生物制药企业、发酵工业企业等建立了良好的合作关系。仪器信息网：天木生物现下主推的产品是什么？聚焦于哪些领域？解决了什么实际问题？天木生物：公司推出的常压室温等离子体（ARTP）诱变育种仪，是一款利用等离子体手段对生物进行诱变育种的专用仪器，具有突变率高、安全性高、诱变速度快等特点，且其结构紧凑，操作简便，能帮助用户快速获得大容量突变库，可广泛用于细菌、放线菌、真菌等工业微生物以及植物、动物等领域。目前，该产品已出口至新加坡、美国、丹麦、日本、韩国、俄罗斯、台湾等国家和地区。常压室温等离子体诱变育种仪ARTP全自动高通量微生物液滴培养仪（MMC），是一款基于液滴微流控技术实现全自动微生物培养和检测的产品。其不仅可以通过配置的芯片生成数百个液滴，将微生物、培养基和化学因子等包裹在微滴中培养，还可以同时进行液滴的分割、融合等操作，实现液滴的自动化连续传代培养。与传统的摇瓶育种相比，该仪器将育种效率提高了近200倍。此外，该仪器还保留了微生物的培养特性，大大提高了筛选精度并减少试剂耗材使用量，从而大幅度降低实验成本。目前，该仪器已在国内多个重点育种机构及高校生物实验室投入使用，并远销海外。全自动高通量微生物液滴培养仪MMC皮升级单细胞分选仪（DREM cell），是基于液滴微流控技术开发的超高通量单细胞分选仪器。将单细胞包裹于微液滴之中进行生长、代谢等，通过其自身荧光蛋白、酶促反应、或代谢物与荧光传感器结合等方式，实现单细胞分选。整个筛选过程通量高、速度快，每秒可以产生上万的皮升级单细胞微液滴，每个工作批次可以完成数十万个细胞的检测分选，筛选效率是传统方法的万倍。液滴微流控细胞分选仪 DREM cell微升级单细胞分选仪（MISS cell），同样基于液滴微流控技术开发，与皮升级单细胞分选仪的区别在于，其液体体系更大，达到微升级；在分选时不仅可以采用荧光分选，也可以采用可见光、质谱、拉曼光等多种体系进行分选，应用场景更加丰富。每台仪器每个批次可实现一千个细胞的分选，工作效率比传统方法提高约十倍。高通量微升级液滴单细胞分选系统 MISS cell生物反应在线检测系统（BODS）， 可对升级至立方级生物反应器进行全自动在线取样、处理、检测、低温留样以及反馈控制，具有取样体积小、多参数检测、全自动、时效性高等特点，可避免人工因取样对反应体系的影响，及时展示反应器内生物量、底物以及产物等过程参数的变化情况，为反馈控制提供及时、准确的数据，提高生物反应过程控制效率，为过程工艺开发、过程优化以及工艺放大提供数据支撑。生物反应在线检测系统BODS仪器信息网：与市场上同类型产品/企业相比，天木生物的主要竞争优势有哪些？天木生物：围绕生物育种、高通量筛选，天木团队已建立了三大核心技术体系，自主开发了十余大类20余款仪器装备。除特色仪器研发外，天木生物立足无锡、洛阳特色生物资源进行综合利用、技术开发，多项科研成果技术成熟，可实现产业化应用。公司已申请专利200余项（其中发明专利近百项），已获得授权发明专利19项（国际发明专利5项）；曾获得第十六届中国专利奖、泰国国家研究评议会特别优异奖、2019年度中国轻工业联合会科学技术发明一等奖、第45届日内瓦国际发明展金奖等奖项；并获得了国家高新技术企业、国家科技型中小企业、河南省“专精特新优质中小企业”、河南省新型研发机构等荣誉资质。仪器信息网：天木生物下一步在市场和产品方面有何具体计划？天木生物：天木生物的远景目标是成为高值生物制品高效开发和技术输出的高科技公司。下一步，天木生物将继续聚焦高通量生物育种及筛选和装备的开发与产业化，在微流控细胞分选领域和细胞抗体领域增加研发投入，助力生物育种和生物制药产业的发展。

天津科技大学谭之磊副研究员研究团队发表在知名期刊《食品研究与开发》上的一篇文章：耐低 pH 值纳他霉素生产菌株的诱变选育。 文章摘要内容如下：纳他霉素是天然多烯大环内脂类抗生素，可以与麦角甾醇基团结合，从而使真菌细胞膜变形，由于其具有优良的抗菌性能，目前除在焙烤食品、乳酪制品、易发霉食品等食品行业上应用外，在医药工业、饲料工业等领域也得到了越来越多的重视，临床上现已用于治疗皮肤真菌感染疾病、真菌性眼角膜炎等。褐黄孢链霉菌是主要的纳他霉素生产菌之一，在其发酵前期 pH 值快速下降，但酸性条件不利于菌体生长和纳他霉素生产。因此筛选耐受低pH 值的菌株不仅有利于纳他霉素生产，也有利于在实际生产中减少耗碱量，降低生产过程中粗放操作对发酵产量造成的影响。本研究采用常压室温等离子体诱变对纳他霉素生产菌株褐黄孢链霉菌TUST01 进行诱变处理，结合低pH值平板筛选及24 孔深孔板高通量筛选获得耐低pH值菌株S. gilvosporeus Y-10。 耐酸菌株Y-10在pH4.0平板上生长良好且在pH4.4和pH7.4摇瓶发酵条件下，纳他霉素产量和生物量较出发菌株都有明显提高。在不控制pH值和控制pH6.3的5 L发酵罐条件下，Y-10生物量较出发菌更高，但纳他霉素产量偏低。高生物量表明 Y-10 具有较好的耐酸性，而纳他霉素产量低可能是由于在 5 L 发酵罐发酵过程中菌体异常上浮导致菌体没有充分利用碳源和氮源。对 Y-10 的耐酸机制进行研究，通过比较 Y-10 与出发菌的胞内三磷酸腺苷水平发现，Y-10较出发菌株有更高的胞内三磷酸腺苷水平，以保证其在酸性条件下的正常生长。而通过气相色谱-质谱联用技术研究发现 Y-10 细胞膜脂肪酸的不饱和度更低，可能影响了其纳他霉素的发酵生产。 文章精彩内容如下：

一、育种领域有哪些？细菌、酵母、藻类、真菌、作物、鱼类...二、育种目标：希望提高有用成分的产出效率希望提高菌株的繁殖能力希望加快生长速度希望增加耐受性希望提高产量希望调整获取时间... ...三、针对育种目标，您可能会遇到以下情况：得不到想要的变异株使用的方法受到限制不愿使用危险品四、生物产业的关键技术问题和解决途径： ▲图丨：摘自陈坚院士报告五、细胞工厂构建，可以利用ARTP原理：ARTP（Atmospheric Room Temperature Plasma）是一种全新的射频放电技术，该技术使用惰性气体放电，能够在常压室温条件下产生大量高能量的活性粒子；研究表明，活性粒子可以有效的用于细胞的遗传物质并导致DNA结构损伤，进而利用细胞自身高容错率的修复机制，产生大量的突变位点，最终获得大容量的基因突变库。六、ARTP具有以下特点：突变性能更强、突变位点更丰富放电条件温和，活性粒子丰富，使用方便安全应用范围广泛，包括植物界、真菌界、动物界、藻类、原生动物、细菌等截止到2022年09月27日，使用ARTP发表的中文文献407篇，英文文献168篇，专利250篇，学位论文174篇，共计999篇与UV相比可以得到多样的变异体，设备具有易操作，机器故障率低，实验等待时间短，安全等特点七、ARTP诱变原理：高纯氦气激发的等离子体富含各种高能量的活性粒子。活性粒子可以透过细胞壁、细胞膜并有效地作用于蛋白质、DNA等。活性粒子对DNA物质产生作用，引起DNA结构的多样性损伤。细胞启动SOS修复机制，形成大量突变位点。诱变后菌株/植株经过筛选获得性状优良的细胞，最终大大地提高生产效率。八、ARTP安全高效：常压室温等离子体ARTP获得欧盟认证及美国UL认证。由于可以在常压室温下进行处理，照射的等离子体温度较低，被证实适用于各种物种。九、ARTP应用案例：Case1：细菌领域成果多、效果显著筛选到高产L-亮氨酸的突变株，产量达到18.55 mg/g，比出发菌株提高2.91倍。（Nature Communications，9（2018）） Case2：霉菌产色素能力大幅度提升突变菌株产橙、黄色素能力比出发菌株分别提高136%、43%。（核农学报，2016,30（4）：654-661）Case3：应用ARTP茂源链轮丝菌，提高所产谷氨酰胺酶的酶活▲图丨：ARTP诱变后的典型菌落特征（G1-G14为形态与出发菌株不同的典型菌落代表；G15为与出发菌株形态相同）采用ARTP技术对链霉菌孢子进行诱变，突变率42.8%，正突变率20.6%，高产突变株G2-1酶活达到2.73U/mL，比出发菌株提高了82%。（微生物学通报，2010，37(11)：1642-1649）Case4：优良植物品系的选育▲图丨玉米矮杆突变M2代                                  玉米矮杆突变M3代ARTP辐照玉米萌动种子，M1代中发现矮秆、分蘖和雄性不育的玉米突变。对M3矮秆突变株系与其亲本基因组DNA重测序表明，ARTP诱导玉米基因组突变率为0.083%，远高于化学诱变。Case5：ARTP诱变育种技术在水产育种中的应用ARTP处理牙鲆受精卵和精子，突变体出现明显的生长性状分离；在全基因组水平，ARTP诱导牙鲆的突变率高达0.064%，远高于ENU在其他鱼类上所获得的突变率。▲图丨常压室温等离子体诱变育种仪ARTP（来源：天木生物）

2022年第九届微生物育种工程与应用评价研讨会暨中国生物发酵产业协会微生物育种分会第六次学术会议通知（第一轮）延期菌种是生物产业的命脉和核心竞争力，是生物企业技术创新和提高竞争力的有力保障。微生物育种、高通量筛选技术与装备创新不仅是国内外科技前沿，也是推动生物产业发展的核心动力。我国的微生物育种技术与装备水平和综合能力较发达国家有很大差距，成为生物产业发展的“卡脖子”环节。近年来，随着新型高效诱变、精准基因编辑和基因组工程、合成生物学及高通量筛选等新技术的不断革新和应用拓展，为微生物育种效率和水平大幅提升带来了创新机遇。为增强生物产业技术领域“产学研”各界的沟通与交流，共同深入探讨微生物育种与高通量筛选的新技术、新方法、新装备和生物育种领域的发展新动态，推动该领域产学研合作，促进我国生物产业发展，自2012年始，由天木生物发起、并由中国生物发酵产业协会、清华大学工业生物催化教育部重点实验室、清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心联合主办了“生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会”系列会议，会议已在石家庄、无锡、洛阳、福州、成都、芜湖等地成功举办八届，已经成为微生物育种领域享有盛名的学术研讨会之一。为了进一步扩大影响力，推动微生物育种工程与应用评价的产学研交流，兹定于 2022 年 11 月 18~20 日在江苏省无锡市召开“第九届微生物育种工程与应用评价研讨会暨中国生物发酵产业协会微生物育种工程与应用评价分会第六次学术会议”。本次会议将邀请国内外知名学术界和产业界的专家、学者、企业家与资深的技术人员做精彩的报告。会务组诚邀业界同仁参会交流！一、会议议题会议将聚焦微生物育种前沿领域的新方法、新技术和新的应用成果，主要包括：工业酶制剂、发酵食品、生物医药等领域的工业菌株改造技术与应用研究成果；合成途径设计与构建、精准基因编辑、基因组工程等合成生物学等新理论在菌种选育中的应用；基于微流控、高通量谱学等技术开发的微生物高通量进化与筛选装备的进展等领域。二、会议时间与地点1、时间：2022 年 11 月 18~20 日（11 月 18 日全天报到）2、地点：无锡市滨湖区君来湖滨饭店三、组织机构主办单位：中国生物发酵产业协会清华大学工业生物催化教育部重点实验室清华大学无锡应用技术研究院生物育种研究中心承办单位：无锡源清天木生物科技有限公司聚树生物科技有限公司北京演绎科技有限公司（DeepTech）安徽省工业微生物分子育种工程实验室四、会议注册代表类型提前注册费用（2022 年 10 月 31 日前缴费）现场注册费用（2022 年 10 月 31 日后及现场缴费） 参会代表1600 元/人1800 元/人学生代表（持学生证）800 元/人1000 元/人缴费方式 : 可现场缴费或汇款，汇款截止日期 11月08日。汇款请注明“微生物育种会议”,报到时请携带汇款证明。单位名称:中国生物发酵产业协会开户行:工行北京阜外大街支行账号: 0200 0492 0902 4904 228五、会议赞助会议诚邀与生物技术相关的企业及公司参会、赞助会议。赞助方案请来电或来信咨询。六、会议筹备处联系方式会务组：中国生物发酵产业协会联系人：             冯志合  电话：010-6839 6574/180 0102 8723  email: fzh@cifa.org.cn             无锡源清天木生物科技有限公司联系人：             张乐乐  电话：188 5158 8869  email: zhanglele@biobreeding.com             北京演绎科技有限公司（DeepTech）联系人：             李仁鑫  电话：185 1950 1200  email：lirenxin@deeptechchina.com             李佳怡  电话：181 3188 1161  email：lijiayi@deeptechchina.com  中国生物发酵产业协会2022 年 10 月 10 日 历届会议回顾 生物育种及高通量筛选技术理论与应用研讨会自 2012 年起分别在石家庄、无锡、洛阳、福州、成都、芜湖成功举办八届，已经成为生物育种领域享有盛名的学术研讨会之一。历届会议规模 200 人以上，汇聚业界精英，专家报告精彩， 代表交流热烈，真正为企业及技术人员和科研单位与科研人员之间搭建了深入沟通的桥梁，与会代表反响良好。  中国生物发酵产业协会石维忱理事长致辞浙江工业大学郑裕国院士做专题报告  江南大学陈坚院士做专题报告北京化工大学谭天伟院士做专题报告  上海交通大学邓子新院士做专题报告水稻育种专家谢华安院士做专题报告 第五届生物育种及高通量筛选技术理论与应用研讨会第六届生物育种技术与装备创新研讨会第七届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会 第八届生物育种暨高通量筛选技术理论与应用研讨会

华中科技大学同济医学院石琦老师研究团队发表在知名期刊《临床口腔医学杂志》上的一篇文章：大气压常温等离子体对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。 文章摘要内容如下：口腔颌面骨组织的再生和修复目前仍是组织再生工程所面临的挑战之一。人牙周膜干细胞( hPDLSCs) 作为牙齿来源的干细胞之一，具有良好的自我更新及多向分化潜能，可作为口腔颌面骨组织再生工程技术的重要干细胞来源。常压室温等离子体( atmospheric room temperature plasma，ARTP) 是在常压和常温条件下产生部分电离气体，诱变可促进干细胞向硬组织如骨、软骨等，或软组织如神经等的谱系特异性分化。本研究探究了常温常压等离子体对人牙周膜干细胞成骨分化的影响。原代培养人牙周膜细胞，采用免疫磁珠法从中分选出 hPDLSCs，通过成骨和成脂诱导培养检测其分化潜能；使用不同诱变时间处理hPDLSCs，行成骨诱导培养，测定细胞碱性磷酸酶( alkaline phosphatase，ALP) 活性，茜素红染色( alizarin red staining，ARS) 及半定量分析法观察细胞矿化结节形成状况，RT-qPCR 测定细胞成骨相关基因的表达状况，测定细胞内活性氧粒子( reactive oxygen species，ROS) 含量变化。采用免疫磁珠法分选出的 hPDLSCs 呈长梭形、多角形，表现出良好的成骨和成脂分化潜能; ARTP 处理1 min 可提高 hPDLSCs 的 ALP 活性，增加细胞内矿化结节形成量; 能够提升 hPDLSCs 成骨相关基因ALP、COL-I、RUNX2 的表达水平; ARTP 提高了 hPDLSCs 胞内 ROS 水平。特定ARTP 诱变时间能够促进hPDLSCs成骨分化，ROS 可能在该过程发挥作用。ARTP 有望成为颌面骨再生治疗的潜在方法之一。 文章精彩内容如下：背景信息                                               常压室温等离子体诱变育种仪ARTP(Atmospheric Room Temperature Plasma)是一种全新的射频放电技术，该技术使用惰性气体放电，能够在常压室温条件下产生大量高能量的活性粒子；研究表明，活性粒子可以有效的用于细胞的遗传物质并导致DNA结构损伤，进而利用细胞自身高容错率的修复机制，产生大量的突变位点，最终获得大容量的基因突变库。图丨常压室温等离子体诱变育种仪ARTP（来源：天木生物）ARTP特点：非转基因手段，突变性能更强、突变位点更丰富专有氦气等离子体有变技术，能量高，基因损伤强度大放电条件温和，活性粒子丰富，使用方便安全易维护、运行费用低应用范围广截止到2022年09月27日，中文文献407篇，英文文献168篇，专利250篇，学位论文174篇，共计999篇应用领域：原核生物（如细菌、放线菌等）、真核生物（如霉菌、酵母、藻类、高等真菌等）及植物细胞。

河北农业大学黄惠琴研究员研究团队发表在知名期刊《中国酿造》上的一篇文章：产褐藻胶裂解酶菌株筛选与高产酶菌株的ARTP诱变选育。文章摘要内容如下：褐藻胶裂解酶是制备生物活性寡糖的重要工具酶，可通过β-消除反应将褐藻酸钠降解为在非还原端具有双键的不饱和寡糖，在食品、农业、工业等行业具有重要的应用价值。由于现有微生物产酶量少、酶活低，限制了其进一步开发应用，寻找新的高效产酶菌、深入研究酶的产生条件、提高菌株发酵酶活力是迫切需要解决的问题。诱变是提高微生物发酵产酶水平的有效方法之一，已成为微生物诱变育种的重要技术。常压室温等离子体（ARTP）诱变是一种基于大气环境温度和射频等离子体的新型微生物诱变育种技术，可在大气压和室温条件下高效诱导脱氧核糖核酸断链，具有条件温和、成本低、效率高的特点，是微生物基因组的高效快速诱变育种技术。本研究采用平板酶解圈法从南海海域海藻、动物及沉积物样品中筛选产褐藻胶裂解酶细菌，对筛选菌株进行分子生物学鉴定，并利用ARTP诱变技术选育高产褐藻胶裂解酶菌株。结果表明，共分离筛选得到酶活较高的细菌14株，16S rDNA比对分析结果表明，它们隶属于3个门、5个纲、7个目、8个科、9个属，其中有5株菌（占35.7%）可能代表着新的分类单元。以高产褐藻胶裂解酶海藻类芽孢杆菌（Paenibacillus algicola）HB172198T作为原始菌株，利用ARTP诱变技术选育获得2株褐藻胶裂解酶活力明显提高的突变株（编号分别为30-19、80-6），其酶活力分别比原始菌株提高了32.6%和21.6%，且连续6次传代培养诱变菌株的产酶遗传性状稳定。文章精彩内容如下：▲图1丨部分筛选菌株酶解圈直径▲图4丨ARTP诱变菌株HB172198^T的致死率曲线▲图6丨高产褐藻胶裂解酶突变菌株遗传稳定性实验结果背景信息常压室温等离子体诱变育种仪ARTP(Atmospheric Room Temperature Plasma)是一种全新的射频放电技术，该技术使用惰性气体放电，能够在常压室温条件下产生大量高能量的活性粒子；研究表明，活性粒子可以有效的用于细胞的遗传物质并导致DNA结构损伤，进而利用细胞自身高容错率的修复机制，产生大量的突变位点，最终获得大容量的基因突变库。▲图丨常压室温等离子体诱变育种仪ARTP（来源：天木生物）ARTP特点：非转基因手段，突变性能更强、突变位点更丰富专有氦气等离子体有变技术，能量高，基因损伤强度大放电条件温和，活性粒子丰富，使用方便安全易维护、运行费用低应用范围广截止到2022年08月29日，中文文献404篇，英文文献167篇，专利230篇，学位论文165篇，共计966篇应用领域：原核生物（如细菌、放线菌等）、真核生物（如霉菌、酵母、藻类、高等真菌等）及植物细胞。

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所卜登攀研究员研究团队发表在知名期刊《动物营养学报》上的一篇文章：常压室温等离子体诱变选育高产二十二碳六烯酸裂殖壶藻藻株。裂殖壶藻是一种海洋微藻，富含二十二碳六烯酸（DHA）等长链不饱和脂肪酸。DHA是 ω-3多不饱和脂肪酸的一种，具有抗氧化、降血压以及预防心脑血管疾病的功能。饲粮中添加裂殖壶藻可显著提高犊牛生长性能，并一定程度上缓解犊牛腹泻，但自然界筛选的野生藻种无法满足工业生产的需要，因此获得一株富含 DHA 的裂殖壶藻生产藻株有重大研究和应用意义。传统紫外及化学诱变存在正向突变率低、诱变效果差等问题。因此，本研究采用常压室温等离子体（ARTP）作为诱变方法开展试验，ARTP是近年来新兴的一种诱变技术，它产生高能氦气等多种活性粒子诱发其产生基因突变，具有操作简便、高效安全、正向突变率高等优点，已得到了广泛应用。      本研究旨在通过诱变选育得到一株高产DHA的裂殖壶藻藻株，为进一步开发缓解幼龄动物腹泻的新型饲料奠定基础。使用裂殖壶藻原始藻株 ATCC20888，通过常压室温等离子体（ARTP）对藻株进行诱变，再进一步通过建立丙二酸、2，2'-联吡啶及丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选方法对诱变藻株进行快速筛选，对筛选突变藻株进行摇瓶发酵，利用磷酸香草醛法和高效气相色谱法对突变藻株的油脂、DHA产量快速检测，得到高产DHA的藻株。结果表明：丙二酸、2，2'-联吡啶及丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选均可以提高裂殖壶藻藻株的平均DHA 产量，较原始藻株分别提高了32.20%、25.01%和29.71%。通过丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选得到的诱变藻株I-F-9，其DHA含量（54.56%）及产量（10.88g/L）分别比原始菌株增加了74.62%和61.17%（P通过ARTP选育的裂殖壶藻藻株I-F-9 较原始藻株 DHA 含量及产量均有显著提高，且其 DHA 产量处于目前同类研究前列。文章精彩内容如下：▲图2丨裂殖壶藻ARTP诱变致死率曲线▲图4丨2,2'-联吡啶筛选裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定▲图5丨复合筛选裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定背景信息常压室温等离子体诱变育种仪ARTP(Atmospheric Room Temperature Plasma)是一种全新的射频放电技术，该技术使用惰性气体放电，能够在常压室温条件下产生大量高能量的活性粒子；研究表明，活性粒子可以有效的用于细胞的遗传物质并导致DNA结构损伤，进而利用细胞自身高容错率的修复机制，产生大量的突变位点，最终获得大容量的基因突变库。▲图丨常压室温等离子体诱变育种仪ARTP（来源：天木生物）ARTP特点：非转基因手段，突变性能更强、突变位点更丰富专有氦气等离子体有变技术，能量高，基因损伤强度大放电条件温和，活性粒子丰富，使用方便安全易维护、运行费用低应用范围广截止到2022年08月29日，中文文献404篇，英文文献167篇，专利230篇，学位论文165篇，共计966篇应用领域：原核生物（如细菌、放线菌等）、真核生物（如霉菌、酵母、藻类、高等真菌等）及植物细胞。

工业微生物常用于重要的生物和化学制品的生产，优良菌株的选育是生物产业的核心工作之一。近年来合成生物技术的快速发展使得高性能工业菌株基因型的理性构建性显著增加，但如何从海量候选菌株库中高通量筛选到规模生产用的工业菌株仍面临挑战。多孔板（MTP）筛选系统和流式细胞术（FACS）是研究者常用的筛选手段，但MTP通量较低，而FACS难以用于检测胞外分泌的代谢物。液滴微流控技术在微生物育种领域的应用，成功实现了大容量突变库的全面评价以及高效筛选，不仅在筛选通量方面实现了大幅度提升，有效提高了菌株选育工作效率，而且在筛选成本方面也展现出巨大优势，可显著降低筛选过程中试剂耗材的用量，将单克隆的筛选成本降低至十分之一或百分之一，实现高通量、低消耗的优良工业菌株选育。天木生物基于液滴微流控技术开发了皮升级单细胞分选平台--DREM cell（Droplet entrapping microfluidic cell-sorter）具有体积小、通量高、体系封闭、无交叉污染等特点，越来越成为科学研究和企业生产的重要技术手段。近日，清华大学张翀、安徽工程大学薛正莲研究团队应用DREM cell将液滴微流控技术与基因编码荧光生物传感器相结合，成功实现了高产谷氨酰胺酶突变株的超高通量筛选，相关研究成果以“Combining genetically encoded biosensors with droplet microfluidic system for enhanced glutaminase production by Bacillus amyloliquefaciens”为题，发表在生物化工领域专业期刊《Biochemical Engineering Journal》上。研究团队开发了一种利用谷氨酸拟荧光蛋白传感器 iGluSnFR 的谷氨酰胺酶荧光检测方法，相较于传统的高效液相色谱法，速度提高了700倍。基于iGlusnFR传感器，结合DREM cell单细胞分选平台实现谷氨酰胺酶生产菌株的高通量筛选，单次实验可筛选10万克隆，效率远远超过传统孔板筛选技术。最终项目团队对常压室温等离子体（ARTP）诱变的解淀粉芽孢杆菌全基因组突变文库进行超高通量筛选，成功获得了一株谷氨酰胺酶产量提高47%以上的突变株。该筛选平台，与微孔板筛选系统相比，筛选率提高500倍，试剂用量减少2万倍，并且可以节省大量的多孔板、培养皿、枪头等耗材。▲图丨液滴微流控高通量筛选平台流程图背景信息研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物）高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等

近日，天木生物DREM cell设备助力中国农大、清华大学完成蜜蜂肠道微生物单细胞高通量培养，实现菌株级别功能多样性研究。 各种不同的生态系统都存在微生物群落，典型的微生物群落包括土壤、海洋或江湖等环境微生物以及人体或动物肠道微生物等。其中，肠道微生物群越来越引起人类的重视，越来越多的证据表明人体肠道微生物群的组成和活性变化与多种疾病和生态表型有关，如糖尿病、肥胖、结肠炎和严重抑郁症等。因此，若研究肠道微生物与宿主的关系，则能够更好地了解肠道共生体对疾病的作用机制，指导从肠道微生物角度出发的新的治疗方法和策略的构建，以达到治疗或预防疾病的目的。 今年6月份，中国农业大学的郑浩团队和清华大学的张翀团队在 Microbiome 上发表了名为“Strain-level profiling with picodroplet microfluidic cultivation reveals host-specific adaption of honeybee gut symbionts”的研究论文，使用高通量皮升级液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）开发基于液滴的微流控技术培养蜜蜂肠道微生物，验证了微流控液滴平台在肠道微生物培养组学中的可行性，为更复杂微生物群落的大规模研究铺平了道路。  （来源：Microbiome） 传统培养方式限制测序技术深入研究微生物的基因型和表型多样性复杂微生物群由多种微生物组成，这些微生物是多物种复合体的一部分。尽管属于同一属和种的微生物拥有一个共同的、且对于细胞功能和物种的生存至关重要的核心基因组，但它们仍然拥有相当数量的菌株特异性基因，导致它们在生理和毒性特性等方面的不同表型，这些差异菌株可能会在不同程度上改变肠道微生物群的功能，进而影响到宿主健康。 因此郑浩表示：仅在物种水平上研究微生物群落是不够的，需要深入调查基因型和表型的多样性。培养是微生物研究的基础方法之一，但实际上由于培养条件的不适合，或是缺少互利共生的个体，很少有微生物可以在实验室条件下轻松培养，对于复杂群落而言，往往也只能成功实现其中一部分占多数的，或快速生长菌株的有效表征，并且传统的培养方式通常是低通量的，丰富的菌株多样性往往会在这个过程中被掩盖。 幸运的是，越来越强大的测序技术出现了，该技术可更深入、更清楚地了解共生肠道微生物组的结构、功能和多样性。16S rRNA 基因测序（16S rRNA gene sequencing）和鸟枪法宏基因组测序（Shotgun metagenomic sequencing）是当前用于微生物群落分析的两种主要工具。 16S rRNA 基因测序一般用于通过选择性扩增和测序微生物 16S rRNA 基因的高变区来识别和分类微生物，可以通过相对少量的原始读长来获得有代表性的细菌分类学估计。其具有高通量，成本低的特点，并拥有相当多成熟的生物信息学工具。但这种方法的主要限制为分类群是根据基因组的单个区域的序列分配的，这导致了分辨率不足。此外，扩增引物的选择也影响很大，一些引物已被证明会导致特定分类群的代表性过高或过低，这可能导致对分类单元的表示存在潜在偏差。 鸟枪法宏基因组测序对从整个微生物群落中分离出来的所有微生物的基因组进行测序。它的优势在于通过收集有关广泛基因组区域的序列信息，能够支持在物种水平上进行更准确的定义，提供更高的分类分辨率。同时还能支持进一步进行菌株水平的重建，得到新的基因或基因组，并对它们进行功能注释和途径预测以产生微生物群落的详细描述。但这种方法成本较高，需要深度测序获得更高的覆盖度以达到令人满意的分辨率，以及更复杂的下游分析。“虽然基于测序的方法不限于可培养的微生物群，但 16S rRNA 基因测序方法在种内分析的分辨率上仍然极其有限，并且可能会被每个基因组的 16S rRNA 基因的多个不同拷贝混淆，这同样会造成对实际存在于环境中菌株功能的误判；鸟枪法宏基因组测序通过考虑更多标记基因或全基因组来提供更多信息，目前也已经开发了许多工具来分析宏基因组数据来解决这些问题，但来自取样时间的或空间的偏差往往需要更深的测序深度来弥补，但这也带来了急剧升高的成本。”郑浩说道。 液滴微流控平台可克服传统培养方式的缺陷因此，若有一种培养方法可突破传统培养方式的局限，则会大大减轻测序技术的压力。基于液滴的微流控平台或许是个不错的选择。液滴微流控微流控（Microfluidics）是指一种在微米尺度空间对流体进行操控的技术，在该技术下可以将化学、生物等实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米芯片上，因此又被称为“芯片实验室”。作为微流控芯片研究中的重要分支，液滴微流控是一种在微尺度的通道内利用流动剪切力或表面张力的改变，将两种互不相溶流体中的离散相流体分割成纳升级及以下体积的微液滴，并驱动微液滴运动对其进行操控的技术。张翀表示：基于液滴微流控的特征，我们可以通过在直径为数十至数百微米并由不混溶的油和工程表面活性剂分割的介质液滴种划分微生物来消除群落培养中过度生长的快速增长种群的影响。由于微制造的物理孔或通道不会限制液滴，因此可以快速创建数百万个独立的培养系统实现单个肠道微生物体的高通量培养。这极大克服了传统培养方式的缺陷，为通过培养来表征来自肠道共生体的稀有类群提供了机会。为了证明微流控液滴平台在肠道微生物群研究中的可行性，郑浩和张翀团队将蜜蜂作为研究对象。原因是与其他动物相比，蜜蜂的肠道细菌简单且稳定，宏基因组分析也表明，虽然蜜蜂肠道由数量有限的细菌系统发育型组成，但仍然存在显著的菌株水平多样性，个别菌株具有独特的基因组潜力和关键能力，这些能力在功能上与宿主的营养代谢和健康相关，为在菌株水平分析肠道共生体与宿主关系提供了很好的模型。具体做法如下：首先，构建了一个微流体液滴平台，并产生了用蜜蜂肠道中的单个细菌细胞包裹的液滴；随后，收集液滴并进行孵育培养，确定了液滴中微生物的生长能力，宏基因组分析揭示了与常规测序方法相比蜜蜂肠道更高的菌株水平多样性，证明了微流体平台在分离和富集稀有微生物菌株方面的潜力。▲图丨微液滴生成（来源：郑浩）最后，结合分箱策略，得到了蜜蜂肠道微生物的大量基因组草图，并进行了功能预测和比较基因组分析。对双歧杆菌属的分析揭示了潜在分类单元的存在，它们在跨膜运输、肌醇利用以及多糖利用方面存在丰富的菌株多样性。研究人员还得到了来自 Lactobacillus panisapium 的新菌株，该菌种在以往的研究中被认为特异性来源于中华蜜蜂；通过进一步的基因组比较，发现来自西方蜜蜂的菌株中独特地含有一组与饮食阿拉伯糖利用相关的代谢基因簇，包括araf43A, rafB, abfA 和abfB，这可能与它对不同蜜蜂宿主的适应密切相关。 ▲图丨微流控液滴中蜜蜂肠道细菌的单细胞封装和培养（来源：研究论文）“总体而言，结果证明了基于液滴的培养在研究蜜蜂肠道微生物多样性方面的适应性，同时这种方法也有潜力适用于其他复杂群落，在稀有类群的获得以及功能鉴定方面发挥作用。”张翀说道。他补充道，对于肠道微生物，当前的研究主要集中在特定培养基质下的微流体液滴培养，结合 16s rRNA 扩增子测序以研究肠道微生物个体的膳食碳水化合物代谢或抗生素耐药性。我们的研究则着重于通过隔离培养以富集在常规状态下难以检测的稀有类群，结合宏基因组的测序和分析，以较高通量实现对肠道稀有微生物的发现，以及代谢途径和功能预测，提供关于宿主和肠道共生体关系的崭新理解。“未来，我们可能会通过调整液滴大小、改善培养条件和测序方法来研究肠道真核微生物，并实现对单胞的高通量识别，这将进一步扩大我们对肠道复杂成员的理解。同时，我们的流程也可以进一步应用于人类肠道共生体的研究，扩展对人类肠道稀有类群以及它们与健康关系的认知和了解。”相关产品 研究团队所使用的液滴微流控细胞分选仪（DREM cell）是天木生物基于液滴微流控技术开发的皮升级液滴微流控单细胞分选平台，可将待筛选细胞进行包被形成单细胞微液滴，结合荧光筛选模型，可以在细胞水平完成微生物的高通量分离、培养、检测、分选等。 ▲图丨液滴微流控细胞分选仪（来源：天木生物） ‍ 高通量皮升级液滴单细胞分选系统（DREM cell）相比于传统筛选方法，筛选效率可提升1万倍，试剂消耗量可下降至百万分之一，在筛选通量显著提升的同时，单克隆筛选成本大幅度降低。该仪器不仅可广泛应用于细菌、酵母、动物细胞等的高通量筛选，还可以应用于蛋白、核酸、抗体等生物大分子筛选等相关研究领域。 项目技术参数液滴体积1-1000pL荧光激发与检测可选波段：（1）激发波长488nm，检测波长525±15nm，灵敏度1μM荧光素/单液滴（2）激发波长532nm，检测波长578±11nm，灵敏度100nM试卤灵/单液滴液滴生产频率0-10000个/s液滴分选频率0-1000个/s微注入速度0-1000个/s样品低温控制系统4℃恒温控制，±0.5℃工作环境常压状态下，室温，30%≤湿度≤80%，洁净暗室整机功率600W应用范围细胞、酵母、细菌、蛋白、核酸等 参考资料：1.https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/125118043具有菌株分辨率的高通量、单微生物基因组学，应用于人类肠道微生物组|科学 (science.org) 

本期为您推荐中国农业科学院北京畜牧兽医研究所卜登攀研究员研究团队发表在知名期刊《动物营养学报》上的一篇文章：常压室温等离子体诱变选育高产二十二碳六烯酸裂殖壶藻藻株。文章摘要内容如下：      裂殖壶藻是一种海洋微藻，富含二十二碳六烯酸（DHA）等长链不饱和脂肪酸。DHA 是 ω-3多不饱和脂肪酸的一种，具有抗氧化、降血压以及预防心脑血管疾病的功能。饲粮中添加裂殖壶藻可显著提高犊牛生长性能，并一定程度上缓解犊牛腹泻，但自然界筛选的野生藻种无法满足工业生产的需要，因此获得一株富含 DHA 的裂殖壶藻生产藻株有重大研究和应用意义。传统紫外及化学诱变存在正向突变率低、诱变效果差等问题。因此，本研究采用常压室温等离子体（ARTP）作为诱变方法开展试验，ARTP是近年来新兴的一种诱变技术，它产生高能氦气等多种活性粒子诱发其产生基因突变，具有操作简便、高效安全、正向突变率高等优点，已得到了广泛应用。      本研究旨在通过诱变选育得到一株高产DHA的裂殖壶藻藻株，为进一步开发缓解幼龄动物腹泻的新型饲料奠定基础。使用裂殖壶藻原始藻株 ATCC20888，通过常压室温等离子体（ARTP）对藻株进行诱变，再进一步通过建立丙二酸、2，2'-联吡啶及丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选方法对诱变藻株进行快速筛选，对筛选突变藻株进行摇瓶发酵，利用磷酸香草醛法和高效气相色谱法对突变藻株的油脂、DHA产量快速检测，得到高产DHA的藻株。结果表明：丙二酸、2，2'-联吡啶及丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选均可以提高裂殖壶藻藻株的平均DHA 产量，较原始藻株分别提高了32.20%、25.01%和29.71%。通过丙二酸-2，2'-联吡啶复合筛选得到的诱变藻株I-F-9，其DHA含量（54.56%）及产量（10.88g/L）分别比原始菌株增加了74.62%和61.17%（P文章精彩内容如下：

本期为您推荐齐鲁工业大学徐振上老师研究团队发表在知名期刊《LWT - Food Science and Technology》上的一篇文章：High-level secretory production of lysostaphin in Escherichia coli mutant by codon optimization and atmospheric and room temperature plasma mutagenesis. 文章摘要内容如下：      溶葡萄球菌酶是一种抗菌剂，可以特异性地溶解金黄色葡萄球菌的细胞壁，因此具有预防金黄色葡萄球菌引起的食物腐败的潜力，但它天然来源的产量低，且模仿葡萄球菌属于致病菌，不适合工业发酵生产。      本研究将溶葡萄球菌酶编码基因进行密码子优化(Opt-lys)，然后连接到pET-22b（+）载体中，在大肠杆菌BL21(DE3)中实现异源表达，结果显示溶葡萄球菌酶也可被大肠杆菌分泌到细胞外。基于此，本研究建立了一种利用双层平板筛选分泌性溶葡萄球菌酶突变体的高通量筛选方法。结合常压室温等离子体（ARTP）诱变方法，获得了细胞外活性最高的菌株BL21(DE3)/pOpt-lys4-18。经过发酵条件优化后，确定其最大胞外活性为155.3U/mL，胞外蛋白浓度达到442.26 mg/L。因此，本研究提供了一种能够高效生产溶葡萄球菌酶的重组菌株和更好的突变体筛选方法，为溶葡萄球菌酶的应用和研究奠定了基础。文章精彩内容如下：