脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有大量的淋巴细胞，占全身淋巴组织总量的25%，在小鼠中，由于小鼠血液量少，从外周血液中分离大量淋巴细胞较为困难，故经常需要从其脾脏中获取大量的淋巴细胞。不久前，来自华中科技大学同济医学院附属同济医院的李老师在Biomaterials杂志上发布的文章中就用到了上述实验。以下为是李老师分享的一些相关经验。 操作步骤1 材料准备选取具有正常免疫功能的成年小鼠（所需的小鼠数量根据实验需要决定，通常一只小鼠脾脏可提取的淋巴细胞数量为2~6×107），快速断颈处死(避免脾梗死)后，浸泡于75%酒精中；准备好已消毒的眼科剪、眼科镊，以及一个装有一定量PBS的无菌皿，分离脾脏后置于皿中，全程无菌操作；2 小鼠脾脏处理脾脏细胞数量较少时，可用两个1mL无菌注射器的针尖将脾脏戳出大量的空洞后，轻轻刮取脾脏表面，将脾脏细胞刮出；数量较多时，可用细胞滤网进行研磨后离心，也可得到淋巴细胞。3 离心15mL离心管中吸入5mL ficoll分离液，倾斜管身，小心吸取含淋巴细胞的PBS缓慢加入ficoll分离液，可见明显液体分层。600rpm梯度离心25分钟，升速/降速均为2；4 二次离心得到分为3层的液体, 小心吸取中间层液体（含淋巴细胞+红细胞）并置于新的15mL离心管，补满PBS，600rpm离心5分钟；5 三次离心弃上清PBS, 可见黑红色沉淀，加入1~2mL红细胞裂解液，冰上裂解5分钟，补满PBS, 600rpm离心5分钟；6 获取淋巴细胞弃上清PBS, 可见白色沉淀，此为总淋巴细胞；计数；7 重悬淋巴细胞将提前过夜包被CD3抗体(包被浓度为5ug/mL)的96孔板中的PBS吸弃，配制淋巴细胞培养基，1640全培+巯基乙醇+CD28抗体(终浓度2.5ug/mL)，重悬淋巴细胞并加入96孔板，100~200ul/孔，通常淋巴细胞数量为1~3×105个/孔。通常8个小时即可看到T细胞增殖团，刺激48h后可以较好活化T淋巴细胞；8 分选若实验目的为分选CD4/CD8 T淋巴细胞，可以省去红细胞裂解操作，直接用磁珠抗体对淋巴细胞进行避光孵育，并用PBS洗掉多余的试剂后，弃上清，用一定量PBS重悬淋巴细胞，缓慢加入预先润湿过的macs tube(已安装到磁力架上)。根据具体试剂和目的可以分为阴选和阳选：阴选需要从分选柱中流下的液体，其中含有目的细胞；阳选则应该等待分选柱中的液体流尽后，将分选柱从磁力架上取下后，并重新加入PBS将分选柱中的阳选细胞冲下，其中含有目的细胞。计数，此后步骤同总淋巴细胞。 注意事项1   由于整个过程需要淋巴细胞长时间处于体外PBS中，所以对PBS的要求比较严格；为保护淋巴细胞，也可以使用专门的淋巴细胞缓冲液，或自行配制含0.4%BSA的PBS缓冲液；2   有些研究为了更好地促进淋巴细胞的杀伤功能，还会在T细胞培养基中添加IL-2; 但是，很多人认为这样也会加速T细胞进入T细胞耗竭的进程，同时会缩短T细胞寿命；3   若后续需要进行流式分析，无法再染CD3 和 CD28分子；4   若用到了OT-I CD8 T细胞，则无需CD3抗体刺激，而是用OVA抗原刺激活化第一信号；5   以上所有操作均以无菌试剂、耗材，无菌环境内操作为前提。 以上为淋巴细胞提取、分选的经验分享，希望对大家有所帮助。同时也欢迎更多老师参与文献奖励活动，分享您的科研干货和心得体会！

实战分享 | 原生细胞的合成之经验分享 近年来，合成生物学的研究如火如荼地开展，其目的在于构建人工分子生物系统并执行定制的功能。来自湖南大学的研究团队使用DNA分子反应网络封装在原生细胞中，以此构建了一种可以持续处理生物环境中波动生物信息的分子CPU（mCPU），该研究成果发表于国际期刊Science Advances（IF=14.96）。原生细胞（protocell）的合成是该领域的一大挑战，下文为此研究团队中的王老师分享的一些相关经验。1合成原理“原生细胞的特点是含有微米级大小的空腔和外部的双层磷脂膜。本论文采用反相微乳液方法制备人工的原生细胞，其特点是几乎可以封装任何物质，包括蛋白，核酸和微纳颗粒，并可以此定制用户定义的分子生物系统。该方法首先将小体积的水溶液加入到大体积（至少10倍）的磷脂油相中，制成大量油包水的乳液，即单层的微米级腔室。然后将该乳液滴入到含有单层磷脂的水相中，即可获得双层磷脂的原生细胞。其中，封装的物质均溶解在小体积的水溶液中。”2合成步骤准备油相 ●  ●首先将储备溶液（溶解在10 μL CHCl3 中的50 mg/mL 磷脂溶液POPC）完全干燥。然后加入 1 mL 矿物油以溶解脂质膜，如 1.5 mL Eppendorf 管A，通过在 85°C 下孵育直到不再可见未溶解的 POPC。准备水相 ●  ●将所需的 DNA 链溶解在含有 5 mM Mg2+的 280 mM 蔗糖中，作为B管中的内部水相。C管是500μL含有单层磷脂的外部水相，由含有 5 mM Mg2+的DPBS 或280 mM葡萄糖，并在水相顶部加入200 μL POPC溶液。制备乳液 ●  ●将 20 μL 内溶液移液到 400 μL 油包脂质中，然后在水浴中超声处理 30 至 60 分钟以形成油包水乳液。制备原生细胞 ●  ●将乳液在室温下平衡 2 分钟并覆盖在管 C 的界面溶液上，然后在离心机中静态孵育 5 分钟。通过以 5000g 离心 5 分钟，获得底部的原生细胞，并在 4 °C 下储存。3注意事项重点难点1高浓度的磷脂溶液需要完全干燥，最好在小容量的玻璃瓶中旋蒸，使之铺成一层的白色薄膜。否则后期很难彻底溶解，会形成大量团絮状的油相杂质。为此，后续的矿物油溶解和乳液形成过程中必要时可以超声。重点难点2从乳液到原生细胞的过程中，很多人无法通过离心获得沉淀产物。因为内部水相和外部水相没有形成密度差，本文采用的是280 mM蔗糖溶液作为外部水相，280 mM 葡萄糖溶液或DPBS作为内部水相。值得一提的是，在两者形成密度差的同时，需要保持渗透压相同以防止原生细胞破裂。经过本文实验，280 mM蔗糖溶液与DPBS渗透压相同，均等同于生理条件下的渗透压285-305 mOsm/kg，因此该原生细胞可以在生理条件下与自然细胞相互作用。管B的乳液加入到管C的外部水相中需要一段时间的静态平衡，使得单层磷脂的乳液充分接触单层油水界面。以上为王老师原生细胞合成的经验分享，希望对大家有所帮助。同时也欢迎更多老师参与文献奖励活动，分享您的科研干货和心得体会！

肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）是近年来发病率急剧上升的恶性肿瘤之一。肝癌细胞系广泛应用于各类肝癌的研究。肝癌细胞系的基因组与健康人细胞系的基因组不同。常见的人肝癌细胞系有PLC、Huh7、Huh7.5、Hep3B、HepG2、SMMC-7721、MHCC97-H、MHCC9-L等，每一种细胞系都有自己的特点，由于它们具有与原代肝癌细胞相似的生物学特性，无生物学改变、特性稳定、无限制传代，为肝癌研究提供了理想的体外模型，成为除动物实验外肝癌疾病研究的又一热门替代物。信裕生物为各位老师整理了实验室常用人肝癌细胞株，如果您正在为选择哪一款肝癌细胞而困惑的话，此文兴许会对您有帮助。1. HepG2 人肝癌细胞HepG2细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。HepG2细胞系基因组和表观基因组相关文献的结果统计显示，HepG2肝癌细胞系的基因组序列创造出更高的基因组特征。充分整合了包括CN、SNPs、SNV等在内的HepG2细胞系的全基因组特征和基因序列，为其他类似细胞系的全基因组鉴定奠定了基础。朱利安娜等人发现β-肌酸对人白细胞的杀伤作用比人肝癌细胞更为明显。单萜类化合物的肝毒性高于HepG2/C3A细胞，优于白细胞。体内研究表明β-肌力相关的致癌和致畸效应需要进一步的实验证实,Arunraj等人发现，复合纳米凝胶对HepG2细胞系具有细胞毒性，Dox几丁质PLA CNG系统可能是一种有前途的肝癌抗癌药物传递系统。人肝癌细胞株HepG2在肝脏生理研究中得到了广泛应用，但肝特异性药物代谢酶和转录因子的表达水平较低。2. Hep3B 人肝癌细胞Hep3B细胞建系于1979年，源自一位患有肝癌的7岁黑人男童。该细胞产生甲胎蛋白（alpha-fetoprotein)、乙肝表面抗原（BHsAg)、白蛋白、巨球蛋白、α-抗胰蛋白酶（alphal-antitrypsin)、转铁蛋白、补体（C3)、C3活性载体，纤维原等，具有广泛的研究价值。Hep3B肝癌细胞cDNA文库的建立及对Hep3B肝癌细胞的毒性研究，有助于我们更好地了解肝癌，选择最佳细胞系进行细胞实验，因此人肝癌Hep3B细胞系长期以来被用于检测治疗药物的疗效、体外细胞毒性、DNA合成和caspase活性。人肝癌细胞主要来源于肝癌组织。通过培养肝癌细胞，并在单细胞水平上进行分析，可以更详细地了解肝癌形成的过程，并将其应用于肝癌生物学研究。使用体外系统进行研究的一个优点是，它们可以比体内研究更快、更便宜。例如，如果你想做肝癌细胞增殖的实验，你可以选择HepG2或Hep3B肝癌细胞，而不是花太多时间来选择它们。HepG2、Huh7和Hep3B的基因组和细胞毒性研究已深入，这些基因对肝癌的发展和晚期药物的开发具有重要意义。3. HuH-7 人肝癌细胞Hidekazu等人于1982年从高分化肝细胞癌患者的组织中分离和培养了Huh 7，但肝细胞癌细胞的遗传图谱尚不为公众所知。Fumio Kasai等人对Huh7肝癌细胞系进行了M-Fish、SNP微阵列序列和序列分析以确定其图谱，他们发现高水平的LOH可以增加染色体重排的可能性，Huh7肝癌细胞在培养过程中对遗传变异高度敏感，另外，不同的代次在体外实验中可能有不同的表达模式。Malinen等人发现，长期分化的Huh-7细胞系是一种很有希望的体外肝毒性和内源性化合物模型，用于药物检测等实验。Jouan等人发现HuH-7细胞上调了一些与法尼醇X受体（FXR）和核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）相关的转运蛋白。这些数据表明，在表达一些主要的肝脏药物转运体时，它可能被用来研究药物与MRP的相互作用。应用：人肝癌细胞系Huh7的基因组特征对传代次数非常敏感，分化后的Huh7细胞可能适合于研究药物代谢酶蛋白表达的肝毒性作用，Huh-7细胞系也常用于研究肝细胞癌的发病机制，它是一种方便、廉价的替代人肝细胞的方法。4. MHCC97H 人肝癌细胞该细胞系由上海医科大学中山医院建立, 将一名我国39岁男性HCC患者的肝右叶转移病灶的手术切除标本接种于裸鼠肝内建造出人肝癌裸鼠转移模型(LCI-D20)而得。已证实, 经过再次分离得到的MHCC97H、MHCC97L及HCCLM33种细胞株，依据它们的转移特点，虽来源同一父系，但具有异质性，即具有不同的转移潜能。MHCC97人肝癌细胞系于1998年从裸鼠人肝癌转移模型(LCI-D20)体外传代培养获得，该细胞系符合一般人恶性肿瘤的病理学和遗传学特征，细胞呈上皮样，贴壁生长，血清HBsAg、AFP高表达，成瘤率高且优先转移的靶器官是肺，肺转移率100%，故证实该细胞系为高转移特性的人肝癌细胞系。2001年，研究者从MHCC97细胞系中发现并分离出不同转移潜能的2个细胞系MHCC97-H和MHCC97-L，前者肺转移率100%，后者40%；从生长速度上，前者细胞倍增时间较后者短；穿透人工基底膜能力前者较后者大；前者均较后者活力强、代谢旺。传代至20代后，两种形态学特征及生长速度方面均较稳定。之后又从MHCC97-H裸鼠接种后成功得到更高转移潜能的HCCLM3细胞系。5. PLC/PRF/5 人肝癌亚力山大细胞PLC/PRF/5人肝癌亚历山大细胞于1976年建系, 细胞来自一位患有原发性HCC的莫桑比克男性患者的标本; 为上皮样贴壁生长; AFP阳性, 不产生白蛋白; 分泌ad亚型的HBsAg而不产生HBcAg或HBeAg和Dane颗粒, 却可维持HAV的繁殖; 该细胞可能含有全部HBV基因组, 同工酶谱及核型与人类同源;裸鼠异种移植可致瘤. 此细胞系因其产生HBsAg的物理化学和免疫化学特性跟HBV携带者血清中HBsAg相似, 因此, 可被用来研究HBV体外病毒及其与原发性肝癌的关联, 抗HBV疫苗所需的HBsAg颗粒的制备及抗病毒药物的制备等方面。人肝癌细胞系优点(1) 在选择实验对象的比较上，人肝癌细胞系相较于人原代肝细胞，克服了人原代肝细胞来源困难、实验难控制、存活时间短的局限，肝癌细胞系为已获得的稳定传代的细胞，具有来源方便、操作简单、条件可控和可重复等优点，是用于肝癌疾病相关研究的理想对象。(2) 肝癌细胞系均选择来源于确诊肝癌患者的病理组织，具有与肝癌患者体内相似的遗传基因组，其发生发展机制、功能蛋白表达、病毒复制能力、侵袭转移功能及抗药性等，具有与人类亲源体极其相近的特点，因此更适合应用于肝癌各领域的研究。

原代细胞培养，也称初代培养，是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养的基本过程包括取材、 培养材料的制备、 接种及培养等步骤，原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。1、组织块培养法基本操作过程1)用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。再用平衡液 (PBS )或 Hanks 液漂洗; 用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块; 再用 PBS或 Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。2)用湿润的吸管吸取切碎的组织块，轻轻吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上。3)将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞。4)将种植了组织块的一侧朝上，静置于 37℃培养箱中;待组织块贴壁 1h 到 3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置。5)每隔 2 到 3 天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。注意事项1)刚接种后，组织块粘附不牢固，观察和转移过程中动作要轻，以防引起液体振荡，使组织块漂起。2)培养初期，要注意观察有无细菌、霉菌污染。3)原代培养要及时观察，记录。4)过3-5天，需要换液以除去漂浮组织块和残留的血细胞，保证原代细胞正常生长。2、分离细胞培养法—贴壁型细胞培养基本操作过程1)首先用细胞分散法收获细胞，随时吸取少量消化液在镜下观察，并根据组织是否分散成细胞团或单个细胞，采取终止消化措施。用筛网滤掉未消化的组织块。2)低速离心细胞悬液，弃掉上清液，加入含血清的培养液，轻轻吹打制成细胞悬液，计数并用培养液调整细胞密度。3)根据培养的细胞类型和实验要求，用吸管吸取一定量的细胞悬液，加到培养瓶中。对于需要特殊底物的细胞，要先将底物涂一层于培养瓶皿底壁，然后接种细胞。4)将培养瓶放入 37℃恒温箱中培养。5)每隔 2 到 3 天更换培养液一次或根据培养液颜色的变化确定换液时间。注意事项1)原代培养的分离细胞在初次接触体外环境时，虽然被分散成单个细胞，但它们之间的互相影响还是存在的， 而且这种影响对细胞能否存活是非常重要的。在这些细胞之间能产生一些促生长的活性物质， 使细胞彼此互相促进存活和生长。如果接种的细胞密度过低， 细胞之间的促生长作用很小， 虽然营养物质很充足， 也很难使细胞适应从体内的组织环境到被分散后进入独立生存环境的变化过程。 如果接种的细胞密度过大，会导致营养物质供应不足， 代谢废物积累较快需要经常换液和传代。2)原代培养时初始培养在组织分散和分离细胞时细胞可能会受到严重的损伤。适当增大原代培养接种的细胞密度， 给培养的细胞提供更多的类似于在体内时细胞之间的相互作用， 会极大提高原代培养的细胞在体外存活率。待细胞适应体外环境后进行传代培养时再以较低的密度接种和培养。3)由于细胞之间的相互的内在联系被打破，分离细胞在体外培养时经历的生存环境改变很大，在体外存活和生长的难度相应增加。 对于贴壁依赖性细胞来说，尽快使接种的细胞贴壁，是决定培养能否成功的关键。可以在接种后先将培养瓶置培养箱内培养 3h 到 5h，由于细胞悬液中带有少量培养液， 细胞即可以维持存活， 又可以很快接触到培养瓶底壁， 是细胞迅速黏附于底物，待细胞贴壁后，再补足培养液继续培养。3、分离细胞培养法—悬浮型细胞培养操作过程1)制备细胞悬浊液，计数并用培养液调整细胞密度。2)在培养皿中加入足够的培养液。3)将欲接种的细胞接种到培养器皿中。4)在培养皿内放入一个有聚四氟乙烯包被的磁棒。将培养皿封口，送入恒温箱内。在磁力搅拌器上边搅拌边培养。若接种培养瓶或试管中，封口后可将培养器皿固定在恒温摇床上，边摇动边培养，无需放置磁棒。有些细胞也可以不用磁棒或磁力搅拌器，也不必使用恒温摇床，接种于预先用硅脂包被的培养器皿内直接在培养箱中静置培养即可。5)培养液略呈黄色换液。吸出部分旧培养液，加入新鲜培养液即可。注意事项1)进行悬浮细胞培养时必须保持细胞的悬浮状态。可以通过增加培养液的黏度来帮助细胞呈悬浮状态，如给培养液中加入低浓度的透明质酸复合物。在有搅拌装置的培养器皿内加入培养液是，以 5ml 为最低限度，否则搅拌时会产生气泡对细胞造成伤害。使用这种方式需注意勿使搅拌速度过快， 否则即可使培养液溢出又容易造成污染。 如果培养液的量在 5ml 以下，可以采用旋转瓶培养。给悬浮培养的细胞换液时要注意不要吸出细胞。2)能够进行悬浮培养的细胞，其生命力一般都比较旺盛，体外分裂增殖的速度较快，营养成分消耗大，换液时间隔一般较短。原代培养的注意事项1）在原代培养的 1 天到 2 天内，要特别注意观察是否有细菌、真菌的污染，一旦发现，要及时清除，防止造成其它细胞的交叉感染；2）随着培养的进程，培养液中的营养物质被逐渐的消耗，营养成分越来越少，细胞代谢产物越来越多，有细胞呼吸过程中释放出来的 CO 2 及其它产物如乳酸、丙酮酸等也逐渐增加。随着酸性物质的增加，培养液中的 pH值越来越低，培养液的颜色也越来越黄。因此，在细胞培养的过程中，要注意培养液颜色的变化，并根据培养液的颜色来决定换液时间。正常情况下，培养液呈桃红色;当培养液呈橙黄色时，细胞一般生长情况良好;呈淡黄色时，可能培养时间较长，营养不足，死亡细胞较多;呈紫红色时， 可能是细胞生长状态不好或已经死亡。所以， 应在培养液略黄时吸出部分旧培养液， 然后补加同等数量的新鲜培养液。换液过程中，不要吸出细胞，不要使培养液溢出培养瓶，避免各种微生物的污染。换液时，应将培养液事先预温至 37℃。一般培养一天，组织细胞即可在培养瓶皿底壁黏附并贴壁生长。 2 天到 3 天后，细胞恢复增殖活动。随着培养时间的延长，细胞数量逐渐增多， 消耗的营养物越来越多， 需要换液的时间越来越短，当细胞逐渐长满培养瓶壁并形成一单层细胞时，细胞之间相互发生接触和联系，逐渐产生接触抑制作用，培养物生长速度减慢。 当培养物最后形成一层完整的细胞单层时，生长几乎停止。在细胞高达 80%融合时就需要进行传代了。原代细胞培养实验注意事项详解1)原代培养材料的选择，尽量选取繁殖能力较强的组织，如胚胎、幼小的生物体或者肿瘤组织等。2)要注意无菌操作。其操作要求应高于外科手术3)整个取材操作要迅速，尤其孕鼠浸泡乙醇时间1min左右，不能过长，以确保胚胎细胞活性。4)运用消化法时胰酶温度应低于37℃，浓度只需平时消化细胞浓度的一半。因为此过程不像消化培养细胞时的1~10min，而是至少20min，先消化下来的细胞在此胰酶消化液中继续消化了10min以上。所以胰酶不能作用过强，否则这些细胞易被损伤而不易生存。5)如使用组织块法，则应待组织块略干燥，能黏附于瓶壁时再使之与培养液接触，匆使组织块漂浮起来。如果组织块没有黏壁，则细胞不易生长，即使生长也因没有贴在瓶壁上，从而因不能观察到而无法收集到生长的细胞。6)原代培养操作时，也可以使用未添加血清的DMEM或PBS洗涤子宫、胚胎或组织块等。7)本实验也可以使用新生乳鼠做培养材料。此时要将乳鼠浸入75%乙醇2~3min使皮肤充分消毒，由于乳鼠原代培养污染概率更高，故应小心操作，避免污染细菌。乳鼠原代培养细胞的存活率不及胚胎细胞培养的成功率。

细胞培养板培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等，孔的底部可以选择平的、圆的，或锥形的，这取决于细胞类型和下游应用。对于传统的2D细胞培养(如HeLa或MDCK细胞)，特别是需要对培养物进行成像或分光光度测定，通常首选平底(F-bottom)。对于不存在接触抑制的细胞，弧形底(C-bottom)也不错。圆底(U-bottom)适合悬浮培养(如球体细胞培养)，因为圆的表面让细胞难以附着和生长。而锥形底很少用于细胞培养实验，但在细胞沉淀时可能有用。以下主要为大家介绍6、24、96孔板接种和换液问题。6孔板接种和换液问题问题1：细胞传代很正常，但一种到六孔板里(不管加药和对照)，总有两三个孔(随机)细胞长得不好，很小，像破碎了。有人遇到过这种情况吗?到底是啥原因呢?答：可能跟加液的温度有关。如果细胞刚刚拿出来换液加液，培养基也是从4度冰箱拿出来不久，很容易细胞就会冻死了。建议最好把培养基先在培养箱里边孵育15min先。另外，跟细胞的生长状态也有关。加药之前的细胞可以用高点的血清浓度培养。保证细胞状态良好。或者放在37度水浴锅里孵育也可以，或者是培养板本身的问题，再换换其他培养板试试看。再有可能就是细胞状态问题了，种板时的血清浓度调高试一下。问题2：用六孔培养板接种细胞，培养24小时后更换培养基，在更换培养基之前，显微镜观察到细胞贴壁，状态非常的好，更换了培养基后，立即用显微镜观察，发现每个孔中都近乎有一半的细胞表现出近乎死亡的状态。细胞变得非常小，产生大量的碎片，而另一半的细胞一切正常，异常细胞与正常细胞之间存在一条分水岭，上半个圆是好的，下半个圆就不好，这是怎么一回事?答：1.可以看一下是不是培养板没放水平。    2.培养液如何，如果培养液过期，细胞就不会贴壁。换一点新配制的培养液试一试。    3.可能是板的问题，换一个牌子的板或换用培养瓶就没问题了。    4.所需换液的培养板多不多，换培养基的时候如果没有注意风机的影响，特别是所需换液的培养板很多时，容易使细胞因风吹失水而干缩破裂。如果如此，换液时应该逐个培养板进行，别怕浪费吸管，注意操作的效率!24孔板接种问题问题1：把细胞消化接种到24孔板之后，已经四天了，老是每孔的中间部分长不满，每天换液时都用PBS 清洗，第二天换液时都出现同样的情况，每孔的边缘长的很好，中央大量死细胞，也不知道是什么原因？答：是中央长不满，还是中央有和边缘相同密度的细胞，但是大部分都是死细胞?如果是前者，也许不是技术问题，而是物理问题了。选择孔内铺盖玻片，在玻片上种植。每次换液都用PBS洗，是必要的步骤吗?另外，也有可能和细胞种类有关或者和培养液有关?如果培养液加的太少了。由于表面张力的作用，培养板的边缘液体会向上走，造成培养液面呈现一个凹面(就像量筒的液体凹面一样)，中央的细胞正好在凹面的最低处，培养液少，细胞的营养不够，甚至干涸掉，空气中的氧气也会造成损伤，即使有增值过来的细胞也会死掉。另外，检查一下培养箱底部的水是否少了，如果少了，箱内的空气湿度不够，会造成培养液挥发加快，这样即使刚加的液体不少，过一段时间，由于蒸发，液体量会减少，造成中央干涸。并且这样会改变了培养液的成分浓度，造成渗透压过高。个人经验认为这是物理问题：24孔板小，细胞接种进去后是很难摇均匀的，结果导致细胞重贴壁后呈现四周密中间稀的状况。至于中间较多死细胞，如果是悬浮状的话，也一样是物理问题。接种后比较粗暴的碰撞，似乎对摇均匀细胞有一定效果。在为多孔板培养的细胞换液时一定要注意，不要把培养基吸得太干，如果完全吸取，很容易造成细胞干涸，这样的话细胞会很快死亡。同时细胞周围密而中间稀疏，大约有如下原因1.培养液加得太少。主要是由于液体张力的问题。2.细胞接种后震荡太厉害了。由于离心力作用导致细胞分布到周围。问题2：细胞在接种在24孔板上时，孔的周围细胞密集，中间细胞稀少，试了很多次均如此。请问怎样操作才能使细胞分布均匀?答：这种情况一般是种板时培养液过少，液面总是呈一凹面，如果液面过低，孔中间就基本上没什么细胞，所以种板时一定不能吝啬培养液，待贴壁后可以用比较少量的培养液处理周围细胞稀少，中间细胞密集:这种情况一般是种板后过于晃动，特别是旋转着晃动.有人才用十字方向的晃动方法使细胞分散均匀.但本公司研究人员认为，将细胞加入孔后，用枪或移液器充分吹打混匀后就不用，也不能再晃动，甚至拿着孔板走路带来的震动都会让细胞往中间集中。当然，无论是哪种情况，首先都需要保证细胞在种板时时均匀分布的，即种板时的细胞悬液一定要混匀。根据细胞的特性，细胞均喜欢聚集在边缘生长，所以考虑到，还有可能是接种时的细胞密度不够，导致周边密集，中间稀疏的错觉。另"要慢慢加样，且记得轻微旋转枪头"。加样不能太快，避免细胞在一个加样处聚集，且注意在不同的部位进行加样，即边加边活动枪头，人为使细胞趋于均匀分布。96孔板细胞接种换液和收集细胞问题1：用96孔培养板培养肿瘤细胞，结果细胞长得不是很理想，不是长得不均匀，就是每个孔细胞生长速度不一样。另外，镜下观察细胞轮廓很不清晰，怎么调焦距效果都不好。(板子是刚拆封的。)不知道怎么回事?答：首先要尽可能把消化细胞消化成单个细胞(不要成团)，反复吹打，掌握好时间(不同的细胞要摸索的)，种细胞时要均匀的吸取，清清的吹打一遍再吸取细胞，这样也许会解决问题。种到96孔板的细胞一定要消化成单个细胞，建议用EDTA和胰酶消化。加血清后反复吹打。细胞量尽量少一点。提议：1、对细胞的选择要注意，要选择状态好的细胞，密度要选分布瓶底80%为宜；2、消化时，不要忘了用PBS(或纯的不含血清的培养基)洗一遍，加0.25%的胰酶1ml消化2-3分钟(不同的细胞有差别，要摸索)，还要不时的活动，让胰酶分布到每个角落，之后倾去胰酶，加3ml培养基(加血清过于粘稠，不宜吹打，加培养基后稀释胰酶可不考虑对细胞的损伤)，吹打成单个细胞；3、接种时要注意细胞密度，多数细胞要求0.5-2的10的4次幂，这也要摸索一下(简单：就是种一个密度，如果在测指标时细胞没过多影响结果就行)；4、周边的孔不要做指标检测孔，有没有发现周边的孔的细胞2天后状态就明显不好了；5、接种细胞调整好浓度后，要一边吹细胞悬液一边接种；6、还有看不清细胞，注意到没有，当把培养板拿出孵箱一会，培养板盖就有一层雾，会影响观察细胞，是不是这个问题?问题2：在96孔培养板上接种的细胞很均匀，但换液时，用枪加150ul的培养基加入每个孔内，结果在显微镜下观察周边细胞全被冲到孔中央去了，而中间的细胞层叠成致密的团块，请问这样的细胞对实验有影响吗?有其他的好办法吗? 是3T3-L1前脂肪细胞，要进行诱导分化成成熟脂肪细胞。所以每次换液总把握不好。请问有谁有这方面的经验吗?答：我们实验室一般用机械吸引器吸引，吸引器管前面套一个20ul加样器的Tip头，效果不错，操作在无菌台内进行。Tip头剪去尖端后灭菌使用，加液时液体呈滴状滴入，就不会扰动孔底的细胞了。建议：加液的时候沿着边轻轻的加入，动作柔和，可以避免冲动细胞；去液的时候直接甩板，方便快捷。去液的时候不建议直接甩板，容易污染。可以剪掉tip尖，不能直接冲细胞，沿孔壁轻轻加入，液体提前在孵箱里预热10分钟，有时候液体凉也会使细胞掉下来。在96孔板中诱导细胞换液一般采用半量换液，这样细胞就不会被冲走了，至于换液的间隔与细胞有关，如果卷得特别厉害，很可能是细胞的问题，建议更新细胞株。问题3：细胞对胰酶和EDTA不管用.高浓度胰酶可以，但细胞存活率不高，有没有小的细胞刮匙，(或者自制刮匙的方法)，可以用于96孔板?(在建细胞系，非得用96孔板)。答：一般情况下细胞在一次性培养瓶或培养板中贴壁较紧，都不太好消化，如果建系的话最好不用刮的方法，还是消化比较好!消化时以下几点注意了吗?消化前用D-Hanks冲洗了吗?可以冲洗2-3遍。适当增加胰酶浓度，提高胰酶PH值到8，减少消化时间应该对细胞影响不大。消化时放入37度培养箱。如果细胞还是消化不下来可加适量胶原酶，有的细胞对胶原酶敏感。问题4：D-Hanks和PBS冲洗效果有何不同?在胰酶消化前一直用PBS冲洗。答：首先，D-Hanks和PBS冲洗细胞都可以的，不过严格来说D-Hanks更好，因为胰酶是用D-Hanks溶的，所以用D-Hanks不改变胰酶的消化环境。第二个问题，完全可以不用wash，加入带血清的培养基之后胰酶将完全没有作用，但是如果EDTA浓度太高的话就需要wash了。

细胞培养板作为培养细胞的一种常用和重要的工具，依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型)；培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等；根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板，形状、规格、用途多样，那么如何选择适合的培养板?细胞培养板的选择1.细胞培养板依底部形状的不同可分为平底和圆底(U型和V型)不同形状的培养板有不同用途。培养细胞，通常是选用平底的，这样便于镜下观测、有明确的底面积、细胞培养液面高度相对一致。因此做MTT等实验时，无论是贴壁和悬浮细胞，一般选用平底板。测吸光值一定要使用平底的培养板。要特别注意材质， 标示“Tissue Culture (TC) Treated”是养细胞用的。U型或V型板，一般在某些特殊要求时才使用。如在免疫学方面，当做两种不同淋巴细胞混合培养时，需要二者相互接触刺激，这时一般会选用U型板，因为细胞会由于重力的作用而聚集在很小的范围内内。圆底培养板还会用于同位素掺入的实验，需要用细胞收集仪收集细胞的培养，如“混合淋巴细胞培养”等。V型板常用做细胞杀伤、免疫学血凝集实验。细胞杀伤这种实验也可用U型板替代(加入细胞后，低速离心)。2.培养孔的孔数有6、12、24、48、96、384、1536 孔等大多数用户在组织培养瓶上开始组织培养。不过，许多应用也需要多孔板。理想的数量嘛，取决于你所需的通量水平，以及是否有机器人的协助。完全手动地向96孔板中添加试剂，这并非不可行，但有电动移液器或机器人的帮助当然更好。扩展到384孔板，就更加需要机器人，而1536孔板更是绝对需要。当然，高密度多孔板的挑战还在于分析小型化。3. 微孔板的颜色多孔板的颜色也与应用息息相关。如果用相差显微镜或肉眼观察细胞，可选择透明的多孔板。不过，对于可见光光谱以外的应用(如冷光或荧光)，有颜色的多孔板(如白色或黑色)则是必需的。在使用从顶部读数的仪器时，底部应该是不透明的，而使用显微镜或底部读数的仪器时，应选择底部透明的多孔板。冷光样品通常选择白色表面，以便最大限度提高信号的反射率，而大于300 nm的荧光应用通常使用黑色表面，以吸收激发信号。有颜色的表面还可以防止相邻孔之间的信号串扰。4. 表面处理选择哪种细胞表面处理，这要取决于你培养的是悬浮细胞还是贴壁细胞。对于悬浮或球体细胞培养，建议使用BRAND inertGrade™微孔板，它经过专利的疏水凝胶处理，可抑制细胞或蛋白附着。对于轻松附着的贴壁细胞(如HeLa)，标准的组织培养表面就足够了。对于那些贴壁有困难的细胞(如原代细胞)，或涉及到严格洗涤的应用，建议使用BRAND的cellGrade™微孔板。这种独特的表面与多聚赖氨酸处理的表面相似，但它不是涂层，而是塑料性质的物理变化，因此不需要冷藏。对于那些敏感细胞或血清量减少的细胞，建议使用cellGrade™ plus表面。5.根据材质的不同有Terasaki板和普通细胞培养板Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting 和handing drop两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS材料，材料是treated sufface，便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface。具体选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。平底和圆底(U型和V型)培养板的区别和选择1.贴壁细胞一般用平底培养板。2.悬浮型细胞的培养一般用V型。3.U型培养板亦多用于培养悬浮型细胞 。4.V型培养板有时用做免疫学血凝集的实验。细胞培养板与酶标板的区别酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，也可以用来测蛋白浓度；酶标板包括包被板和反应板，一般不用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，需要更高的要求和特定的酶标工作液。常用不同培养板的孔底面积及推荐加液量不同孔板所加培养液的液面都不宜太深，一般在2~3mm范围，结合不同孔的底面积就可算出各培养孔的适宜加液量。若加液量过多会影响气体(氧气)交换，而且在搬动过程中易溢出造成污染。具体所加细胞密度依实验的目的不同灵活掌握。不同型状的板子自然有不同用途平底的什么类型的细胞都可用，但当细胞数目较少，如做克隆时，就用96孔平底板。另外﹐做MTT等实验时，无论贴壁和悬浮细胞，一般均用平底板。细胞培养板问题集锦问题1：培养板有4、6、12、24、48、96孔几种规格 ，但不知道到底什么实验用哪种规格？答：要根据具体的实验要求，流式一般用6孔，MTT一般用96孔，细胞爬片一般用24孔等!要具体根据实验来定。问题2：请问Terasaki板与普通细胞培养板有什么区别？答：Terasaki plate主要是用于晶体学研究，产品设计便于对晶体的观察与结构分析。有两种sitting 和handing drop两种方法，两种方法应用产品的外形结构也不同。材料上选择crystal class polymer ，特殊的材料有利观察晶体结构。细胞培养板主要是PS材料。材料是treated sufface。便于细胞贴壁生长与伸展。当然还有浮游细胞的生长材料，同时还有low binding surface，有关更多实验材料上的应用与对材料的选择。问题3：想测吸光度用酶标仪，用多孔细胞培养板行吗?请问酶标板多孔细胞培养板有什么区别?答：用多空细胞培养板测吸光度肯定可以拉，我们经常用它来做样品的蛋白定量和MTT检测。区别：酶标板一般要比细胞培养板贵，细胞板主要做细胞培养，但也可以用来测蛋白浓度;酶标板包括包被板和反应板，一般不能用做细胞培养，它主要做免疫酶联反应后的蛋白检测，它需要更高的要求还需要特定的酶标工作液。以上就是关于细胞培养板的选择内容，各位科研老师选择时根据培养细胞的类型、所需培养体积及不同的实验目的而定。

当我们需要运输或者长期不用某种细胞时，通常会使用冻存的方法来保存。若未做好细胞冻存，还会直接影响后续细胞复苏状态，所以细胞冻存的重要性不容小觑。本期信裕细胞学堂将带来贴壁细胞和悬浮细胞的冻存操作步骤及注意事项，以便大家查漏补缺。在进行冻存操作前，可预先配置好冻存液；若使用无血清非程序冻存液，则无需自己配制，也无需使用程序降温盒。01贴壁细胞冻存操作◆ 将待操作的细胞去上清，用PBS润洗；◆ 去上清，加入胰酶消化，消化完成后加入完全培养基终止消化，并吹打均匀制备成细胞悬液；◆ 1200rpm（250g）3min离心后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；◆ 加入配置好的冻存液重悬，一个T25培养瓶长到80%左右密度的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照3~5×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5~1mL/支；◆ 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；◆ 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；◆ 最后将冻存管转移至液氮长期保存。02悬浮细胞冻存操作◈直接将细胞悬液于1200rpm（约250g）3分钟离心后尽量吸干净上清，收集细胞沉淀；◈ 去上清，用配置好的冻存液重悬细胞，一个T25培养瓶长到传代密度时的细胞量可冻存1支，或者细胞计数后，按照3~5×106cells/支冻存，冻存液用量推荐0.5~1mL/支；◈ 分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；◈ 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；◈ 再转移至液氮长期保存。注意事项01细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中；02应选择汇合度80%-90%左右，处于对数生长期时的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整；03程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都要复温至室温备用；04冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤；05冻存细胞长期保存应放置于液氮，不建议在-80℃长期保存；

2017 年是 CAR-T 细胞疗法的元年，使得越来越多的人开始关注细胞治疗领域，包括干细胞治疗、TCR-T 疗法等等。几乎所有的细胞治疗都有一个共同点，即都需要使用细胞因子来诱导细胞增殖或分化。细胞因子虽然在细胞中含量很少，但是种类丰富，并且是作用广泛，那么，到底什么是细胞因子?细胞因子的作用是什么?怎么选择合适的细胞因子?我们一起来看看。　　什么是细胞因子?　　为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的小分子量可溶性蛋白与多肽类因子，这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细胞因子。　　它们在细胞之间传递信息，可广泛调控机体免疫应答、细胞生长分化以及造血功能，并参与炎症损伤等病理过程，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。　　细胞因子包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。　　细胞因子的分类：　　■ 白细胞介素因子(interleukin，IL)：由淋巴细胞、单核细胞或其它非单个核细胞产生的细胞因子，在细胞间相互作用、免疫调节、造血以及炎症过程中起重要调节作用。　　■ 集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)：能够刺激不同发育阶段的造血干细胞和祖细胞增殖的分化，还可促进成熟细胞的功能。　　■ 干扰素(interferon，IFN)：最初发现某种病毒感染的细胞能产生一种物质可干扰另一种病毒的感染和复制，因此得名。由白细胞、成纤维细胞和活化T细胞所产生，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用。　　■ 肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor，TNF)：最初发现这种物质能造成肿瘤组织坏死而得名，除具有杀伤肿瘤细胞外，还有免疫调节、参与发热和炎症的发生。　　■ 转化生长因子 -β 家族(transforminggrowthfactor-βfamily，TGF-βfamily)：由多种细胞产生，主要包括 TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGFβ1β2 以及骨形成蛋白(BMP)等。　　■ 趋化因子家族(chemokine family)：能够趋化细胞的迁移，吸引白细胞移行到感染部位，在炎症反应中具有重要作用。　　■其它细胞因子：如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、白血病抑制因子(LIF)、神经生长因子(NGF)等等。　　细胞因子的作用：　　细胞因子研究有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和治疗，因此相关研究具有非常重要的理论和实用意义，应用前景广阔。　　利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于治疗肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好的疗效。　　作用类型：参与免疫应答与免疫调节、刺激造血功能、细胞因子与神经-内分泌-免疫系统网络。　　作用方式：1. 自分泌作用。2. 旁分泌作用。3. 内分泌作用。　　作用特点：多效性、重叠性、协同性、拮抗性。　　必看：细胞因子产品选择标准　　种属来源：　　我们可以提供多种不同种属来源的细胞因子等重组蛋白，例如人源、小鼠源、大鼠源等等，可以根据实验需求选择合适的种属。　　一般来说，不同种属之间蛋白同源性(序列一致性)在80%以上的基本上可确定为有交叉活性，可推荐使用。　　表达系统：　　最常用的细胞因子表达系统是大肠杆菌表达系统和哺乳细胞表达系统，此外还有酵母表达系统和昆虫表达系统等。　　目前，临床和实验室应用的细胞因子大多来源于大肠杆菌。选择表达系统之前需要充分了解自己的研究目的，根据应用来选择最合适的表达系统。　　例如有些蛋白需要经过翻译后修饰才具有活性，哺乳动物细胞可以提供这样的修饰，但细菌细胞往往不能。　　因此，在选购这类蛋白时更要特别留意产品说明书中的蛋白来源。　　重组蛋白常用表达体系　　质量指标：　　细胞因子的质量对实验的影响不容小觑，一旦选择失败将直接导致实验无法顺利开展，浪费时间和精力，因此选择质量有保证的产品至关重要，好的品牌会对其蛋白产品进行各种质控，以确保蛋白的品质和实验效果。　　若用来作为动物免疫抗原进行检测类抗体的研究，纯度大于80%即可;若用于晶体及晶体结构研究，纯度要大于95%。　　推荐：信裕细胞因子——细胞培养常用的GMP级高品质蛋白　　随着细胞研究的深入，对细胞培养各方面的要求也越来越高。但是血清的成分较为复杂，会对一些高要求的基础研究的结果产生较大的影响，尤其是药物分析、新药研发等方面。而且血清中还含有一定的细胞毒性物质和抑制物，对细胞分化产生作用，影响某些功能的表达，甚至有些细胞是不能在血清中存活的。因此无血清培养基正在崛起。　　想要利用无血清培养基使细胞生长状态良好，必须添加一定量的合适的细胞因子，如EPO、NGF、PDGF、EGF、M-CSF等。我们的GMP高品质细胞因子，无动物源性、低内毒素、批间稳定性好，可广泛用于细胞研究中细胞的培养和分化以及高要求的细胞培养基制备，为您的细胞培养助力。　　产品特点　　原核、酵母、昆虫、哺乳动物四种表达系统平台　　严格的产品质控体系，完善的客户服务流程　　蛋白纯度高，活性高，内毒素含量低　　细胞培养实验验证产品有效性　

首先，我们来了解下动物细胞培养什么是动物细胞培养？动物细胞培养，就是从动物有机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞,然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。动物细胞培养的原理动物细胞培养原理是细胞增殖。动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞（使用trypsin或胶原蛋白酶），放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。细胞培养是指细胞在体外条件下的生长，动物细胞在单独细胞培养的过程中不再形成个体。体外细胞培养所需营养物质与体内基本相同，例如，需要糖、氨基酸、无机盐、促生长因子、微量元素等。将细胞所需的上述物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。由于动物细胞生活的内环境还有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入动物血清以提供一个类似生物体内的环境，因此在使用合成培养基时，通常需加入血清、血浆等一些天然成分。                                                              动物细胞培养过程图动物细胞培养常用培养方式一、半连续式培养1.半连续式培养半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。 这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至最大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次的稀释、换液培养过程，细胞密度常常会提高。2.半连续式特点a.培养物的体积逐步增加；b.可进行多次收获；c.细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。 该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。二、连续式培养1.连续式培养连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种与一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。理论上讲，该过程可无限延续下去。2.连续培养的优点连续式培养是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺，维持在一个较低的水平，从而使他们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。然而在高的稀释率下，虽然死细胞和细胞碎片及时清除，细胞活性高最终细胞密度得到提高；可是产物却不断在稀释，因而产物浓度并为提高；尤其是细胞和产物不断的稀释，营养物质利用率、细胞增长速率和产物生产速率低下。3.连续式培养不足a.由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染；b.在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异；c.对设备、仪器的控制技术要求较高。 连续式培养操作使用的反应器多数是搅拌式生物反应器，也可以是管式反应器。4.连续式培养的特点a.细胞维持持续指数增长；b.产物体积不断增长；c.可控制衰退期与下降期。三、灌流式培养1.灌流式培养灌流式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出部分条件培养基时，绝大部分细胞均保留在反应器内，而半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。 灌流式培养常使用的生物反应器主要有两种形式。一种是用搅拌式生物反应器悬浮培养细胞，这种反应器必须具有细胞截流装置，细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统，最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。 中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜，透过小分子量的产物和底物，截流细胞和分子量较大的产物，在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内；近年来中空纤维生物反应器被广泛应用于产物分泌性动物细胞的生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。 另外一种形式是固定床或流化床生物反应器，固定床是在反应器中装配固定的篮筐，中间装填聚脂纤维载体，细胞可附着在载体上生长，也可固定在载体纤维之间，靠上搅拌中产生的负压，迫使培养基不断流经填料，有利于营养成分和氧的传递，这种形式的灌流速度较大，细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应，适合于固定化细胞的培养。2.灌流式培养的优点a.细胞截流系统可使细胞或酶保留在反应器内，维持较高的细胞密度，一般可达107-109/ml，从而较大的提高了产品的产量；b.连续灌流系统，使细胞稳定的处在较好的的营养环境中，有害代谢废物浓度积累较低；c.反应速率容易控制，培养周期较长，可提高生产率，目标产品回收率高；d.产品在罐内停留时间短，可及时回收到低温下保存，有利于保持产品的活性。 连续灌注培养是近年用于动物细胞培养生产分泌型重组治疗性药物和嵌合抗体及人源化抗体等基因工程抗体较为推崇的一种方式。应用连续灌流工艺的公司有Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。这种方法最大困难是污染机率较高，长期培养中细胞分泌产品的稳定性，规模放大过程中工程问题。四、细胞工厂培养细胞工厂（cell factory）是一种设计精巧的细胞培养装置。它在有限的空间内利用了最大限度的培养表面，从而节省了大量的厂房空间，并可节省贵重的培养液。更重要的是，它可有效地保证操作的无菌性，从而避免因污染而带来的原料、劳务和时间损失。它是对传统转瓶培养的revolution。 丹麦NUNC公司生产的NUNC细胞工厂是目前应用较多的细胞工厂系统。可用于如疫苗、单克隆抗体或生物制药等工业规模生产，特别适合于贴壁细胞，也可用于悬浮培养，在从实验室规模进行放大时不会改变细胞生长的动力学条件，可提供1，2，10和40盘的规格使放大变得简单易行，低污染风险，节省空间，培养表面经测试保证最有利于细胞贴附和生长。同时，与NUNC的细胞工厂操作仪结合使用，可全面实现细胞培养的自动化，从而大大地减低劳动强度和密集度。 这套系统使用很方便，可产生类似塑料培养瓶的效果。由组织培养级聚笨乙烯制成，使用后可随意处理。其最大缺点是：经胰酶消化后，很难将细胞completely洗出。

双11·科研人省钱攻略活动时间2022年11月11日-2022年12月21日活动内容活动一：全线ELISA Kit，下单返“现”每买一盒96T规格，可获得88元红包每买一盒48T规格，可获得50元红包活动二：精品系列-6.5折出售货号产品名称价格XY9701-50植物基因组DNA提取试剂盒¥550XY9702-50动物基因组DNA提取试剂盒￥450 XY90002NR总RNA提取试剂￥518XY9B1805植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）￥1152XY9B1806动物组织/细胞总RNA提取试剂盒（双柱型）￥1062XY90082ZLDNA凝胶回收试剂盒￥380XY90083ZL高纯度质粒DNA小量提取试剂盒￥380XYD9303无内毒素质粒大量提取试剂盒￥998XY9709NC核酸清除剂￥500XY92121.1×S4 Fidelity PCR Mix ￥375XY9A06781.1×S4 Fidelity PCR Mix(dye-)￥375XY9A06012×GS Taq PCR Mix￥200XYF9201-B2×GS Taq Master Mix￥200XY9A05782×GS Antitaq PCR Mix￥600XY9312STriumfi Mouse Tissue Direct PCR Kit￥1299XY9311STriumfi Plant Direct PCR Kit￥1299XY9712KUniclone One Step Seamless Cloning Kit￥1280XY9A2363UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)￥1890XY9A2364UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR￥1500XY9A2465GS AntiQ qPCR SYBR Green Master Mix￥1200活动三：细胞系买一株细胞系，送DMEM/MEM/IMDM/RPMI-1640/无血清细胞冻存液 1瓶+50元红包买3株细胞系，送DMEM/MEM/IMDM/RPMI-1640/无血清细胞冻存液 2瓶+200元红包买5株细胞系，送DMEM/MEM/IMDM/RPMI-1640/无血清细胞冻存液 3瓶+500元红包买10株，送一株活动四：重组蛋白每满2000元，送100元红包活动详情图

单克隆抗体生产技术于1975年由Köhler和Milstein发明。作为功能分子的单克隆抗体不仅可用于基础科学，还可用于药物、测试药物、生物传感器等领域。近年来，以单抗为主的药物在中小药品销售中占主导地位，预计到2023年底，市场收入将达到2189.7亿美元左右。    单克隆抗体有两种类型：一种是识别初级蛋白结构的线性表位的抗体，另一种是识别二级、三级和更高结构的抗体。在生命科学研究中，使用识别线性表位的抗体包括ELISA和Western blot方法。然而，使用这类抗体的应用有限，而结构识别抗体有广泛的应用，如免疫沉淀，免疫染色等。正因为，单克隆抗体有如此广泛的应用，所以，作为一名合格的科研工作者，必须了解这一技术及相关知识，所以，今天要给大家讲解的内容就是“单克隆抗体”的知识。如果大家感兴趣的话，就接着往下看吧！单克隆抗体的概念单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。单克隆抗体制备的流程图单克隆抗体制备的操作流程01免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。具体操作如下：根据抗原的特性选择合适的免疫方案，对于可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂。常用佐剂为福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状。初次免疫，Ag50ug/只，加福氏完全佐剂皮下多点注射，一般 1.5 ml, 间隔 3 周。第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂，间隔 3 周。第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7 天后采血测其效价，检测免疫效果，间隔 3 周。加强免疫，剂量 50ug，腹腔注射。3 天后，取脾融合。02细胞融合采用二氧化碳气体处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作步骤如下：（1）饲养细胞的制备在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常必须加入其他活细胞使之繁殖，这种被加入的活细胞称为饲养细胞小鼠腹腔巨噬细胞的准备：用 6-10 周龄的 BALB/c 小鼠。拉颈处死，浸泡于 75% 的酒精，消毒 3 min, 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜。用吸管注入 6 ml 培养液，反复冲洗，吸出冲洗液。放入 10 ml 离心管，1200rpm 离心 5 min.用 20% 小牛血清的培养液混悬，调整细胞数为 1*105/ml. 加入 96 孔板，100ul/孔。放入 37 度孵箱培养。（2）骨髓瘤细胞的准备于融合前 48-36 小时，将骨髓瘤细胞扩大培养融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于 50 ml 离心管或融合管内。1000r/min 离心 5-10 分钟，弃去上清。加入 30 ml 不完全培养基，离心洗涤一次。然后将细胞重悬浮于 10 ml 不完全培养基，混匀。取骨髓瘤细胞悬液，加 0.4% 台酚蓝染液作活细胞计数后备用。（3）脾细胞的准备取已经免疫的 BALB/c 小鼠，摘除眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于 75% 酒精中 5 分钟，于培养皿上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有 10 ml 不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。，使脾细胞进入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。通常每只小鼠 1×108-2.5×108 个脾细胞。（4） 细胞融合将 1×10^8 脾细胞与 1×10^7 骨髓瘤细胞 SP2/0 混合于一支 50 ml 融合管中，补加不完全培养基至 30 ml，充分混匀。1000r/min 离心 5-10 分钟，将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀;用 1 ml 吸管在 30s 内加入预热的 50% PEG1 ml，边加边轻轻搅拌。吸入吸管静置 1 min。加入预热的不完全培养液，终止 PEG 作用，连续每 2 min 内分别加入 1 ml,2 ml,3 ml,4 ml,5 ml,10 ml.800rpm,5 分钟；弃去上清。加入 5 ml 完全培养基，轻轻吹吸沉淀细胞，使其悬浮并混匀，然后补加完全培养基至 40-50 ml。分装 96 孔细胞培养板，每孔 100ul, 然后将培养板置 37℃，5% CO2 培养箱内培养。6 h 后补加选择培养基。每孔 50ul. 3 天后用选择培养基半换液。经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出上清供抗体检测。03选择性培养选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。具体操作步骤参考如下：抗原用包被液稀释至 10ug/ml。以 100ul/孔量加入酶标板孔中，置 4℃ 过夜或 37℃ 吸附 2 小时。弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗 3 次，每次 3 分钟，拍干。每孔加 100ul 封闭液 37℃ 封闭 1 小时；洗涤液洗 3 次；每孔加 100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃ 孵育 1 小时；洗涤，拍干。加酶标第二抗体，每孔 100ul，37℃ 孵育 1 小时，洗涤，拍干。加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液 100ul，37℃20 分钟。以 2mol/L H2SO4 终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取 OD 值。结果判定：以 P/N≧2.1，或 P≧N+3SD 为阳性。若阴性对照孔无色或接近无色，阳性对照孔明确显色，则可直接用肉眼观察结果04杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用灵敏、快速、特异的免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过全面鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。具体操作步骤如下：制备小鼠脾细胞为饲养细胞。制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含 20% 血清的 HT 培养基稀释至每毫升含 5、10 和 20 个细胞 3 种不同的稀释度。按每毫升加入 5×104-1×105 细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。每种杂交瘤细胞分装 96 孔板一块，每孔量为 100ul.37℃、5% CO2 培养 6 天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。05单克隆抗体纯化单克隆抗体的纯化方法同多克隆抗体的纯化，腹水特异性抗体的浓度较抗血清中的多克隆抗体高，纯化效果好。按所要求的纯度不同采用相应的纯化方法。一般采用盐析、凝胶过滤和离子交换层析等步骤达到纯化目的，也有采用较简单的酸沉淀方法。目前最有效的单克隆抗体纯化方法为亲和纯化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗体与载体（最常用Sepharose）交联，制备亲和层析柱将抗体结合后洗脱，回收率可达90％以上。蛋白可与IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3结合，同时还结合少量的IgM。洗脱液中的抗体浓度可用紫外光吸收法粗测，小鼠IgG单克隆抗体溶液在A280nm时，1.44（吸光单位）相当于1mg/ml。经低pH洗脱后在收集管内预置中和液或速加中和液对保持纯化抗体的活性至关重要。好啦，以上就是本期的所有内容，想了解更多科研实验技术知识，关注我，你离技术大佬就不远了！咱们下期再见！

细胞的活性鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。它是体外细胞培养技术中常用的一个检测指标。不同的细胞活性鉴定方法有各自不同具体的反应机理，但无论采用哪种方法，都利用了死细胞和活细胞在生理机能和性质上的差异。常用的方法有直接染色法，克隆形成试验，比色法等。下面我们就简单的了解一下常用的细胞活性检测方法的原理，特点，以及各自的优缺点。一、染色计数法化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法,直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力,检查细胞活性,能在光学显微镜下观察到染色结果.可分为两类:死细胞着色法和活细胞着色法.使死细胞着色的常用染料有台盼蓝,苯胺黑,伊红Y.能使活细胞着色的常用染料有结晶紫,亚甲基蓝,甲苯胺蓝等.其中最常用的是台盼蓝染色法….细胞损伤或死亡时,台盼蓝可穿透变性的细胞膜,与解体的DNA结合,使其着色,而活细胞能阻止染料进入细胞内,故可以鉴别死细胞与活细胞.通过细胞计数可得出细胞的存活率.优点：方便实用，价格低廉，操作简单缺点：时间不宜过长,否则部分活细胞也会着色,会干扰计数.而且,细胞没有经过固定,形态不清晰.荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果,利用荧光显微镜检测细胞活性.如碘化丙锭。(PI),被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜,因此活细胞不被染料染上色,只有死细胞或是凋亡细胞才能染上红.色.叶啶橙(AO)能透过质膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光.溴化乙锭(EB)仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核DNA,发橘红色荧光.也可应用AO—EB双染法鉴定细胞死活.优点：这种检测方法相比传统的染料,具有灵敏度高,操作简便,结果容易分辨等特点,而且利用双染法还可以分辨活细胞,凋亡早期细胞,凋亡晚期细胞,死亡细胞，在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。缺点：要求特殊的仪器进行检测,如荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪.而且通常荧光染料具有毒性,操作作时需要带手套.二、克隆形成试验克隆形成试验是测定单个细胞增值能力的有效方法之一,其基本原理是单个细胞在体外持续分裂增殖6 次以上,其后代所组成的细胞群体,称为克隆或集落.一般情况,每个克降可含50个以上的细胞,大小在0.3~~I.0mm之间.通过计数克隆形成率,可对单个细胞的增值潜力做定量分析.常见的方法有平板克隆形成试验,软琼脂形成试验等.这种方法常见于抗肿瘤药物敏感性试验,肿瘤放射生物学试验等.优点：在低剂量辐射下,克隆形成试验比 MTT和SRB法的敏感性更强.缺点：较为繁琐并耗l时,不适合同时监测大量样品,而且在手动计数过程中带有非常大的不确定性,特别是当形成的细胞克降大小差异较大时,很难得到更有效,精确的数据.三、比色法比色法便是利用活细胞还原力，尤其是线粒体中脱氢酶，将底物还原后检测吸光值的改变来衡量活细胞还原力。在对细胞还原力的检测中，培养液中若存在还原酶类，例如谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST），可能会使测定结果偏离,真实水平偏高。目前应用的底物以刃天青盐类和四唑盐类为主，在四唑盐类的底物中尤其以灵敏度高、重复性好、毒性极低的CCK-8很受欢迎。下面跟小编一起比较一下这两类底物的优缺点吧！1. 刃天青（resazurin）刃天青溶液呈蓝色，通常用作酸碱指示剂（pH3.8橙～6.5深紫）和氧化还原指示剂。在进行细胞活性检测时，刃天青可渗入细胞并被活细胞不可逆地还原为粉红色，同时有红色荧光的试卤灵（resorufin）出现。试卤灵的吸光值或荧光强度与细胞数量、还原能力呈正相关，因此可通过任一参数来评估细胞活性。2.四唑盐（tetrazolium salts）四唑盐（表1）是一种人工合成的杂环化合物，它可被活细胞还原生成甲臜（Formazan），不同的四唑盐衍生物作底物会得到不同颜色的甲臜，与试卤灵一样，甲臜的吸光值大小与细胞数量、代谢活性呈正相关，并以此作为细胞活性强弱的指标（图1）。图1 四唑盐显色原理表1 四唑盐的类型以上是本期文章的全部内容，检测细胞活性的方法的优缺点你是不是清楚了？好了，我们下期见。

蛋白定量是生物学研究中不可能或缺的一个步骤，根据其目的可分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白的“个别定量”。在蛋白质的提取、纯化和分析过程中，蛋白质的定量随处可见。比如在裂解细胞之后，应对各个样品中的蛋白进行定量，确保下游实验的数据平行度；在电泳之前进行定量，保证上样量一致，这样目的条带含量的变化才有说服力。蛋白质的结构复杂、种类繁多、功能各一、分子量存在巨大差异，目前还没有一个理想且通用的蛋白定分析方法。如今最常见的方法主要有以下几种：BCA法测定bicinchonininc acid01原理BCA(bicinchonininc acid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即 BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+,一个Cu*螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，较大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。02特点灵敏度高，检测浓度下限达到25ug/ml，最小检测蛋白量达到0.5ug，待测样品体积为1-20ul 。测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton x-100，5%的Tween 20，60， 80。在20-2000ug/ml浓度范围内有良好的线性关系。检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响:EDTA小于10mM。DTT小于1mM疏基乙醇低于1mm。BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。03优缺点操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便;准确灵敏，试剂稳定性好，BCA 试剂的蛋白质测定范围是20-200ug/ml ,微量BCA测定范围在0.5-10ug/ml。经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量;抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响考马斯亮兰法bradford01原理考马斯亮蓝（CBB)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，较大光吸收在488nm;当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm 波长下有较大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速;其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比 Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0~1 000ug/ml ,是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。02优缺点优点：灵敏度高，据估计比 Lowry 法约高四倍，其较低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质–染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry 法要大的多。测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性较好。因而完全不用像Lowry 法那样费时和严格地控制时间。干扰物质少。如干扰 Lowry 法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、疏基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用v一球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、Triton x-100、十二烷基硫酸钠(SDS)和0.1N的NaOH。(如同0.1N 的酸干扰 Lowary法一样)标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。紫外分光光度法测定bradford01原理蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280nm波长处，在较大吸收波长处，吸收光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯-比尔定律，故可作为蛋白质定量测定的依据。02优缺点优点：方法简单、灵敏、快速、高选择性，且稳定性好，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。缺点：仪器昂贵，而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差，受光源、溶液的PH值、比色皿材质、缓冲介质溶液等因素的影响和限制。Lowary蛋白定量法Lowary01原理Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，在加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍，为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。02优缺点优点：微克级高灵敏度定量测定，稳定。缺点：受植物体内存在的酚类物质干扰。去污剂如TritonX-100，SDS，NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。

科研工作属实不易，除了实验技术上的难度，还要实验之外的考验。尤其是科研产品采购这方面，这一方面还是比较重要的，因为好的实验产品，能让你在实验操作时更顺利，结果更好。所以说，这期间就需要很多试错成本。这次，信裕生物，为了给客户降低实验试错成本，精选了20多款热门试剂盒产品的试用装，助力百万科研工作者找到心仪的产品。免费试用活动时间：2021年11月22日-2021年1月22日申请流程：步骤一：注册商城会员并充值300元储蓄（充值300元，可领取价值1000元的满减新人大礼包）步骤二：关注公众号，回复“试剂盒申请表”步骤三：填写并提交申请表步骤四：等待审核（通过邮箱方式\电话通知审核结果）审核通过，等待收货即可注：收到货后需要在一个月之内提供反馈表，发至邮箱“shxysw02@163.com”，邮箱主题格式为“姓名+单位+试用装货号+反馈表”。反馈表获取途径：关注公众号->后台留言“试用装反馈表”->打开百度网盘链接->输入提取密码（shxy）-下载文档试用装产品列表：产品名称产品货号检测范围Human CORT(Corticosterone) ELISA KiXY9H48602.81-180ng/mlHuman S100A1/S100(Protein S100-A1) ELISA KitXY9H03800.156-10ng/mlHuman INS(Insulin) ELISA KitXY9H03740.156-10ng/ml=100uIU/mlMouse EGF(Epidermal growth factor) ELISA KitXY9M000715.6-1000pg/mlRat IgG2a(Immunoglobulin G2a) ELISA KitXY9R10806.25-2280ng/mlHuman IgA(Immunoglobulin A) ELISA KitXY9H04150.781-50ng/mlHuman TGFβ1(Transforming Growth Factor Beta 1) ELISA KitXY9H028731.25-2000pg/mlMouse MPO(Myeloperoxidase) ELISA KitXY9M001062.5-22800pg/mlRat IL-1β(Interleukin 1 Beta) ELISA KitXY9R109431.25-2000pg/mlHuman TNFα(Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA KitXY9H030215.6-1000pg/mlRat VEGF-D(Vascular Endothelial Cell Growth Factor D) ELISA KitXY9R142515.625-1000pg/mlMouse IFNγ(Interferon Gamma) ELISA KiXY9M009315.625-1000pg/mlMouse ICAM-1(intercellular adhesion molecule 1) ELISA KitXY9M00920.313-20ng/mlRat E2(Estradiol) ELISA KitXY9R15070.703-45ng/mlRat NFkB(Nuclear Factor Kappa B) ELISA KitXY9R15080.156-10ng/mlMouse IL-3(Interleukin 3) ELISA Kit (XY9M0116)XY9M011615.625-1000pg/mlHuman OT(Oxytocin) ELISA KitXY9H421215.625-1000pg/mlRat bFGF(Basic Fibroblast Growth Factor) ELISA KitXY9R151115.625-1000pg/mlMouse IL-1a(Interleukin 1 Alpha) ELISA KitXY9M010815.625-1000pg/mlRat HSP-90(Heat Shock Protein 90) ELISA KitXY9R1058125-8000pg/mlHuman IL-13(Interleukin 13) ELISA KitXY9H326615.625-1000pg/mlMouse IL-2(Interleukin 2) ELISA Kit XY9M011231.25-2000pg/mlRat ICAM-2(Intercellular Adhesion Molecule 2) ELISA KitXY9R10620.781-50ng/mlHuman IFN-α(Interferon Alpha) ELISA KitXY9H325215.625-1000pg/mlMouse TNFα(Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA KitXY9M018331.25-2000pg/mlRat IL-1α(Interleukin 1 Alpha) ELISA KitXY9R109315.625-1000pg/ml活动说明：试用装同一课题组限申领一次（试用装规格均是24T）该活动的最终解释权归信裕生物公司所有如有其它问题请咨询销售人员

1.什么是感受态细胞（1）感受态细胞其实是一种暂时性改变一下细胞膜的通透性，以利于外源DNA（如质粒）进入细胞。这样的活细胞称为感受态细胞。（2）主要原理其实就是通过特殊的方法处理使细胞，使细胞膜的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源DNA（如重组质粒或者运载体）进入感受态的细胞。2.感受态细胞制备原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法(如:电击法，CaC12等化学试剂法)处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。常见的感受态细胞的制备方法一般有：化学制备法和物理制备法3.化学制备法大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌ACaC12的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中,重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子(Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70C保存，因此被广泛用于外源基因的转化。4.物理制备法电转法（原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受）5感受态细胞制备具体步骤1. 从 37 ℃ 培养 16～20 h 的平板中挑取一个单菌落（直径 2～3 mm），转到一个含有 100 ml LB 或 SOB 培养基的 1L 烧瓶中。于 37℃ 剧烈振摇培养 3 h。一般经验，1 OD600 约含有大肠杆菌 DH5α 109个/mL。2. 将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的 50 ml 聚丙烯管中，在冰上放置 10 min，使培养物冷却至 0℃。3. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 特头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。4. 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使后的痕量培养液流尽。5. 每 50 ml 初始培养液用 30 ml 预冷的 0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液（80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2）重悬每份细胞沉淀。6. 于 4 ℃ 用 Sorvall GS3 转头（或与之相当的转头）以 4 100 r/min 离心 10 min，以回收细胞。7. 倒出培养液，将管倒置 1 min 以使后的痕量培养液流尽。8. 每 50 ml 初始培养物用 2 ml 用冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2（或 TFB） 重悬每份细胞沉淀。9. 此时，可以用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻存于- 70 ℃。6感受态细胞制备及转化的影响因素（1）、细胞的生长状态和密度从-70℃或-20°C甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0．5时，细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。(2)、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。(3)、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4°C。(4)、防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。(5)、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。

双十一马上就要来了你们是不是快要被各种活动搞晕掉了？感觉自己的智商像是被侮辱了一样。我们科研人的精力当然要用在科研上这种小事怎么能劳烦我们未来的科学家们操心呢？小编，已经帮大家做好了活动攻略了大家，快来抢购吧！活/动/详/情Activity details活动一：爆款产品6.5折促销购买细胞生物学部分产品6.5折促销（其中包括细胞系、细胞培养试剂：无血清细胞冻存液/快速转膜液/抗体稀释液）爆款促销产品目录活动二：满额送京东卡活动期间，订购试剂盒、血清产品的，单笔订单满额即可获得相应的京东卡礼品。满3000元，送100元京东卡满5000元，送200元京东卡满10000元，送500元京东卡满50000元，送1000元京东卡活/动/说/明Activity description本活动不于其他活动同时享用满赠礼仅单笔订单，具体活动可咨询销售客服最终解释权归信裕生物所有

01电泳的发展简史1809俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象1909首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳1937创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的。1948Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。1950Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质(如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等)作为支持介质的区带电泳方法。1959Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。02电泳的基本原理电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。03琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳原理:琼脂糖凝胶具络,物质分子通过时到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相比于蛋白质太大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳最主要区别是:心兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。2.琼脂糖凝胶电泳用途:用于DNA切胶回收；用于DNA分离；用于佐证DNA是否重组、质粒是否切开以及其他分子生物学研究3.琼脂糖凝胶电泳特点：I、优点：因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒等大分子物质。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定有热可逆性II、缺点：机械强度差，易破碎，浓度不能太低。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。04琼脂糖凝胶电泳操作步骤01配胶1.制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液.02制胶板取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全疑固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加03加样在点样板或pa rafi lm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).04电泳加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.05影响琼脂糖凝胶电泳因素DNA分子的大小凝胶的浓度DNA的构象使用的电压琼脂糖的种类电泳缓冲液嵌入染料的存在以上这些因素都会对电泳产生影响，具体详细内容就不在这里给大家一一介绍了，以后大家遇到什么问题的话，都可以从这几方面入手去找问题。下面我来列举一些DNA电泳常见的问题以及分析其原因。06DNA电泳常见问题分析

上期文章我们讲到了关于CHIP的定义、原理、步骤以及应用，这一章节，我们就针对CHIP实验，讲解一下CHIP实验的一些注意事项以及一些常见的问题解析想要做好ChIP实验，必须要控制好这几个方面，包括培养基内活细胞数量、交联时间长短、抗体的种类和特异性、常规实验操作技术等多种因素影响 。想要控制这些过程，最核心的就是全面设置对照组。下面逐个做说明。活细胞数量活细胞计数后，如果最终用于ChIP实验的细胞数量太高，将直接导致甲醛交联时间增加，间接导致细胞数量/微球菌核酸酶比例增大，这些均可造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp），实验处理过程中极易丢失这些片段，最终也会造成PCR检测困难或失败。最家的DNA片段长度是150bp-300bp。相反，如果过细胞数量太少，则导致细胞数量/微球菌核酸酶比例减小，最中得到的DNA片段极可能小于100bp。总之，你所研究的DNA-蛋白丰度直接决定了ChIP实验所需的细胞数量，没有固定的数量标准，这些都需要预实验充分摸索。交联时间长短 交联与超声破碎的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验易出现假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍，另外也会增加背景。可以通过超声结果来判断超声效果，超声破碎后的DNA片段大小一般在100-500bp是效果比较好的，因为不同的样本交联时间和超声时间不同，可以提前通过预实验来确定。 一般来讲，根据经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如，NIH－3T3的交联条件是室温（一般为25 ℃）下15min，1％的甲醛浓度，不同的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。抗体的种类和特异性 抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。单抗和多抗两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。一般而言，如果没有十足把握，比如单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），建议选择多抗比较稳妥一点。实验操作技术 操作时，尽可能的保持低温（4度）。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500 rpm等）离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，但还是能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止，尽量避免实验中不可预知的影响因素。常见问题分析没有特异性抗体01如果目标蛋白没有商业化的抗体可选，一种方式是定制抗体，之后进行 ChIP 验证。这种方式的优点是检测到的是内源性的蛋白，结果反映的一定是体内真实的蛋白和 DNA 相互作用。另一种方式是给目标蛋白加标签，通过标签检测目标蛋白。AM-Tag 标签是专门针对 ChIP 设计的蛋白标签。通过质粒构建加到目标蛋白 C 端。转染进入细胞之后通过特异性 AM-tag 抗体进行 ChIP。Active Motif 实验室通过构建雌激素受体（ER）加 AM-tag 标签质粒检测 AM-tag ChIP 效果，结果数据与发表文章中使用 ER 抗体检测内源性蛋白结果一致。没有足够的起始样本02ChIP 是一项富集技术，不是纯化方法。大部分我们感兴趣的蛋白或组蛋白修饰分布在整个基因组，只是不同区域的富集度不同。因此，有意义的结果需要高效的富集。传统的 ChIP 实验需要至少两百万细胞作为起始材料，这对于有些珍贵细胞样本是非常困难的。解决这个问题的关键是通过 ChIP 的 buffer 及条件优化，降低非特异性的背景，实现最有的信噪比。针对这个问题，一方面通过 buffer 条件优化，提供高灵敏 ChIP 试剂盒，最少可用 1000 个细胞进行 ChIP 实验。另一方面，也提供低细胞量的 ChIP-Seq 服务，对于高丰度目标蛋白（如组蛋白修饰）仅需 10000 个细胞；对于低丰度目标蛋白（如转录因子），仅需 50000～500000 个细胞。如何检测染色质上蛋白之间的相互作用03RIME（Rapid Immunoprecipitation Mass spectrometry of Endogenous proteins）是一项 ChIP 和质谱分析相结合的技术。非常适合用于鉴定转录辅助因子和染色质相关蛋白的相互作用。传统的鉴定蛋白相互作用的方法是 IP 之后进行质谱分析。与 IP 方法不同，RIME 使用的起始材料经过交联，主要检测的是染色质上蛋白之间的相互作用。染色质为什么要片段化？片段化的长度为什么是200-1000？片段化过度或不足对实验会有什么影响？04片段化的目的是缺保高分子量染色质的蛋白质/DNA复合物是可溶的，能被ChIP抗体接近；为确保ChIP实验有良好精度，一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linker DNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有700个核苷酸的距离；如果过度片段化可能破坏抗原表位降低PCR效率，片段化不全导致样本丢失，可能会获得假阴性结果。免疫沉淀过程中琼脂糖珠和磁珠有什么区别，哪一种Beads的效果更好呢？05在早期文献报道以琼脂糖珠为多，琼脂糖珠的优点是价格便宜，但是样本需离心，时间长，另外珠子在离心过程中可能破裂。琼脂糖珠存在非特异性结合，因此需要“预先清洗”染色质，除去可能与蛋白G琼脂糖非特异性结合的蛋白质或DNA。另外分层不明显，样品容易丢失。当前主流的方法是以磁珠方法较多，磁珠的好处是样本无须离心, 操作时间短，另外磁珠表面光滑，背景低，因此无需封闭。磁珠还有一个好处是带颜色，分层清晰，样品不会丢失，但是磁珠需要需磁力架。因此在免疫沉淀是建议选择磁珠的方法。免疫沉淀的时候，我的样本、抗体和磁珠加样和反应顺序对实验结果有什么影响？有要求吗？06一般有3种反应顺序：染色质样本+抗体先反应，然后加磁珠；抗体+磁珠先反应，然后加染色质抗体；染色质样本+抗体+磁珠 三者同时反应。 无论选择哪种微珠，使用磁珠或琼脂糖珠的顺序可能影响您的ChIP信号。一种方法先将微珠与捕获抗体共同孵育（室温下几小时，或4°C过夜），接着加入染色质（样本），继续孵育（4°C震荡孵育1小时至过夜）。增加孵育时间有可能增加背景和ChIP信号；然而，与靶点亲和力低的抗体即使延长（过夜）孵育，也不产生明显的ChIP信号。第二种方法将抗体与染色质样本先共同孵育，再加入微珠也能获得和一种反应顺序相似的结果，均能较好的进行免疫沉淀反应。但是不建议同时加入这三个组分进行免疫沉淀反应，有实验验证显示同时加入三个组分虽然能减少开展整个反应所需的时间，但是和上述两种方法相比，结果较差。当然，这里我只是列举了一部分问题，在实验过程中还可能碰到许多种问题，这就需要考验我们的耐心和细心了，好啦，今天的内容到这里就结束了，更多精彩内容请关注我们

对一个实验室新手来讲，提到ChIP，您可能没听过这个词，他的全称叫染色质免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation),今天就带大家来学习一下CHIP实验的相关知识，咱们主要从CHIP的定义、原理、步骤以及应用以下几点给大家分析介绍，希望能帮助大家更好的做CHIP实验什么叫ChIP？染色质免疫沉淀（ChIP）用于分析基因组中特定染色体区域中组蛋白乙酰化状态的实验方法，被用来研究细胞内DNA与蛋白质相互作用。是目前确定与特定蛋白结合的基因组区域或确定与特定基因组区域结合的蛋白质的最好方法。ChIP的原理？在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分6步：（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联 ；（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；（5）DNA 纯化回收；（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。ChIP的一般流程甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。ChIP的步骤基本的ChIP 实验包括五个步骤（如下图），分别是交联、染色质片段化、免疫沉淀、DNA 回收和纯化以及分析 DNA。由于实验材料的不同，可能会造成在交联和染色质片段化方面存在一些不同，需要不断优化条件，才能得到高质量的 DNA 从而进行后续的 ChIP 分析。1、交联固定一般采用1% formaldehyde（甲醛）室温交联10-30分钟，交联的目的是为了建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接，这个过程要注意一下几点。（1）一定要使用新鲜甲醛溶液，因为甲醛容易被氧化，导致交联不充分，在后续染色质剪切的时候则容易破坏蛋白和DNA的共价连接。（2）交联的时间10-30分钟，如果研究对象为转录因子等丰度比较高，和DNA结合也很稳定，交联10min即可，如果研究对象为转录辅因子等丰度比较低，也不是直接与DNA结合，则适当延长交联时间至30min。2、染色质片段化根据染色质剪切方式的不同，目前市面上提供两种试剂盒，酶解法和超声法的试剂盒。酶解法则是在交联处理之后，加入适量的核酸酶特异性的切割核小体，将核小体切割成以1个、2个……核小体为单位的片段。到这里，有些小伙伴可能就摩拳擦掌准备接下来的免疫沉淀了，但是小优提醒您，酶解之后，样品并没有完全切割好，还需要经过短暂的超声处理，把细胞膜和核膜充分打碎，使染色质片段完全释放出来。如果是超声法，则比较简单了，调整到合适的超声功率，将样品超声处理适当的时间就好了。在这个过程中要摸索好超声的条件，过度超声有可能破坏染色质完整性，会给ChIP实验富集带来负面影响，尤其是转录因子和辅因子。3、免疫沉淀向样品中加入抗体将目的蛋白和连接的DNA拉下来。这个过程中引入protein G微珠，将目的蛋白和与它结合的DNA拉下来，这个过程中或多或少也会把其他杂蛋白一起拉下来，所以接下来进行高盐和低盐的洗脱，去掉杂质。在这个过程中选择合适的抗体对实验结果至关重要。如果您需要做测序，则要选择ChIP-seq级的抗体，如果只是做PCR，选择ChIP级抗体即可。因为ChIP级抗体除了要结合完全裸露的靶蛋白之外，还要结合因构象变化被DNA遮蔽的抗原表位，而ChIP-seq则需要检测全基因组上大量的成千上万的基因位点。所以要严格选择相应级别的抗体。4、DNA 回收和纯化用蛋白酶K解交联，消化染色质的蛋白质组分和DNA之间的连接，然后经过DNA纯化柱对样品进行纯化。5、分析 DNA纯化好的DNA进行PCR或者测序分析。ChIP的应用1转录因子利用 ChIP 检测特定的转录因子在基因组中的结合位置及序列，可发现下游基因的顺式调控元件，从而帮助完善转录因子参与的分子通路。2转录机制ChIP 可用于检测 RNA 聚合酶II以及其他转录组分的结合位点，从而发现启动子和增强子的序列，同时也可能发现新的转录调控机制。3组蛋白特异性修饰位点ChIP 研究在组蛋白密码的发现和表征方面起着关键的作用，通过 ChIP 可发现组蛋白特异性修饰的水平，同时也可明确组蛋白的修饰对基因的调控作用。

上海信裕生物科技有限公司作为一家生物高新技术企业，公司秉承“专注品质、信守承诺、积极沟通、创新服务”的企业文化积极参与生物领域的技术创新和技术服务，力求为我国科研事业更好的，更专业的服务，在业界已经赢得了广大客户的良好口碑。为了感谢广大科研用户在生命科学领域所作出的贡献，以及对信裕生物产品的信任和支持，信裕生物特推出“文章有奖征集”活动，对使用信裕生物抗体或elisa产品发表期刊文章的用户，给予现金奖励。活动时间：2021年9月1日——12月31日奖励标准：2≤影响因子（if）200元奖学金4≤影响因子（if）400元奖学金6≤影响因子（if）600元奖学金影响因子（if）≥10，奖励1000元奖学金申请须知：1、本活动仅对使用信裕生物抗体或elisa产品发表期刊文章的用户给予现金奖励；2、申请人必须是文章第一作者或第一通讯作者，且2020年9月1日起发表的文章；3、文章中必须标注信裕生物中文名或英文名（xinyu biology）的字样；4、须保证文章的真实性，以及引用产品信息（如产品货号及名称）的准确性；5、一篇文章限奖励一次，如同一产品实验用途一致，发表在不同期刊杂志视为一篇；6、本活动最终解释权归信裕生物所有。奖励申请流程：将准备好的电子版论文和论文发表的证明材料（如录用函等），以及申请表“2021年信裕生物文章奖励申请表.docx”，发送指定邮箱shxysw02@163.com，邮件主题为“文章征集+申请人姓名”。我们在收到您的邮件后会与您取得联系，告知您奖励是否审核通过，并与您确认领奖事宜。如何获取申请表：关注公众号→关于我们→文章奖励申请表→点击链接→输入提取码（shxy）

上面这张图，大家有没有一种熟悉的感觉，没错，就是你想的核酸提取实验流程图。相信大家作刚开始做为实验小白，刚进实验室时，学的第一个实验就是提质粒了。当时刚进实验室，看着师兄做实验的样子好酷呀！跟在师兄后面，认真的对每一步的步骤都做好笔记，后来才发现你只不过是做了一份手抄版的说明书。接下来的N年里，除了转化、涂板、挑单克隆、摇菌、提质粒、酶切、连接，此时此刻，只想有个提取质粒的机器人。因为做多了之后，你就会像个机器人一样，最后甚至连提取的原理都会遗忘了。所以，今天小编就来给大家讲一讲提取质粒的原理，以及操作步骤等。质粒提取原理质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。质粒DNA提取的应用（1）快速纯化质粒；（2）用于测序、体外转录与翻译、限制性内切酶消化、细菌转化等分子生物学实验。提取质粒的基本步骤（1）细菌的培养和质粒的扩增（2）细菌菌体的裂解（3）质粒DNA的纯化一、摇菌培养1. 将鉴定测序正确的克隆菌液涂在LB固体平板。（一种培养基，使质粒扩增）。2. 置于37℃恒温培养箱，培养12-17h，待长出菌落。3. 灭菌15ml离心管内加入5ml含抗生素的LB液体培养基，编号标记。4. 挑取单克隆菌团放置液体培养基，每个培养基放置1个菌落。5. 37℃，180rpm，振荡培养过夜。二、收获细菌并裂解1.离心扩增好的菌液，按说明书将菌液重悬，转入1.5ml离心管中。2.用质粒小量抽提试剂盒，按说明书要求提取质粒。3.细菌高速离心1min,彻底去除上清。4.加入250ulRB溶液，振荡器充分悬浮细菌。5.加入250ulLB溶液。立即上下颠倒10次，使细菌裂解，室温，放置2min。6.加入250ulNB溶液。立即上下颠倒10次，使之充分中和，室温，放置2min。7.室温，1500rpm，高速离心15min。everybody,让我们摇起来！8、将吸附柱放入收集管内，离心得到的上清转移至吸附柱，室温，15000rpm，高速离心30s。9、弃废液，将吸附柱放入收集管，加入700ul WB溶液到吸附柱中，15000rpm，高速离心30s。10、重复上一操作。11、将吸附柱放入干净的1.5ml 离心管中，加30-50ul预热的Elution Buffer，室温，放置2min，高速离心1min。12、样品进行电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，上样量为2ul，紫外灯下观察，最明亮的带为超螺旋形式，可以在一定程度上表明提取质粒的纯度。三、质粒的纯化1. 将之前提取好的质粒放入1.5ml离心管中，加入1/10体积的3mol/L 无菌乙酸钠溶液。2. 加入2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或过夜。3. 4℃，高速离心机14000rpm，离心20min.4. 弃去上清，70%乙醇洗2次。5. 空气干燥，可置超净工作台干燥。6. 加200ul无菌水溶液干燥后所得沉淀，即为质粒溶液。7. 紫外分光光度计测量质粒浓度和产量。测量OD260和OD280的值：质粒DNA浓度=OD260×50×稀释倍数（μg/mL）。质粒提取的方法质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟据不同的实验目的和仪器设备择取不同的实验方案。01碱裂解法此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下:1.接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。2.37°℃振荡培养过夜。3.取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。4.加加o.1lm1溶液I(1%葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0,25mML Tris-HC1 pH8.0)充分混合。5.加入0.2ml溶液II(0.2 mM/L NaOH，1% SDS)，车轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。6.加入0.15m1预冷溶液III(5 molLKAc, pH4.8),轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。7.以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8.加入等体积的异戊醇，混匀后于0℃静置10min。9.再以10，000rpm离心20min，弃上清。10.用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。11.待沉淀干燥后，溶于0.05mlTE缓冲液中02煮沸法1.将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4C下12000g离心30秒。2.弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3.将菌体沉淀悬浮于120m1 STET溶液中，涡旋混匀。4.加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml)，涡旋振荡3秒钟。5.将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。6.用微量离心机4C下12000g离心10分钟。7.用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8.取20ml进行电泳检查。03酚氯仿裂解法1.从琼脂平板上挑取转化菌阳性克隆，接种到标准LB培养液中(含有卡那霉素30 ug/mL)摇菌12 h;收集1.5 mL菌液，8000 g/min离心3 min，弃上清，沉淀加入200 _uL TE，充分混匀;加入400 uL酚氯仿(1 : 1体积）混合液，剧烈振动10 s，混匀;12 000g/min离心5 min，1 mL胰岛素注射针收集上清，尽量避免吸入蛋白沉淀层;上清经国产0。22 um针式滤器过滤1次;向过滤上清液内加入2倍体积无水乙醇，振荡10 s,12 000 g/min离心5 min;沉淀溶于20uL的RTE溶液中，37°℃水浴。2.按PstI内切酶说明书进行酶切反应(37°C，1h)。酶切产物10 uL,10 g/L琼脂糖凝胶电泳。3.PCR引物根据参考文献〔1〕设计，预计扩增产物片断大小为714 bp。4.常规制备感受态菌E。coli DH5a，提取质粒DNA常规转化感受态，涂于含有卡那霉素(30 umL)LB培养平板中，37C培养，15 h后观察筛选克隆情况。好啦！今天的分享就到此结束啦！大家还想了解什么，欢迎大家公众号给小编私信哦！咱们下期再见！

前几期，我们讲了其中包括它的概念、原理、应用场景、操作步骤以及注意事项等。相信大家也对Western Blot有一定的了解了，那这一期呢？我们就来给大家总结一些，在做Western Blot实验时，会经常遇到的问题，对这些问题，我们对此分析其原因以及解决方案。希望对各位，能找到你的答案！Western Blot（蛋白质印迹法）作为生物研究领域的必备实验技能对于一个经验丰富的实验者来讲提起Western Blot,不胜其烦所以，对于科研小白那就是望而生畏了虽然这是一个基础实验但这里的操作细节多、实验时间长，这样就导致了，有些实验小伙伴由于操作不细致，往往会出现各种各样的问题当然，有时候也要靠运气，懂的都懂。说多了都是泪尽管如此，有些坑大家还是可以规避的下面，就向大家分享一些WB实验中经常碰到的“坑”常见问题及解决方案01 无条带或弱条带02 条带位置（大小）不对或有非特异性条带03 出现黑点和黑斑04条带中出现边缘规则的白圈05 背景高06 电泳过程中出现现象及问题（1）整个条带呈 “ ︶ ” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（2）整个条带呈“ ︵ ”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错。（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。07其他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。

很多同学都反馈，重组蛋白在经过Ni柱纯化之后就形成沉淀了，使得辛苦一天的纯化工作付之东流。为了解决这一困扰，今天我们就一起探讨这个问题形成的原因及应对措施。区分首先，大家要区分蛋白沉淀是分为可逆沉淀和不可逆沉淀两种形式的。可逆沉淀是指在一定条件下，蛋白发生沉淀，空间结构变化，当撤去变性条件时，蛋白又恢复活性的现象。典型的例子如盐析，高浓度强电解质破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜，同时又中和了蛋白质所带的电荷，使其失去稳定因素而聚集，当降低盐浓度时，活性又恢复。不可逆沉淀是指剧烈的物理化学作用如高温、射线、极端pH等破坏蛋白质分子中次级键，导致空间构象彻底不可逆而失去活性的现象。蛋白沉淀思考对于蛋白发生沉淀的现象，我们可以从以下几个角度去考虑。1、是否和其本身的性质有关，例如蛋白表达时，形成的二硫键过多，导致蛋白易聚集沉淀，蛋白为膜蛋白或疏水基团较多，由于疏水作用力聚集沉淀；2、纯化过程中，需要考虑蛋白所处的环境是否正确。例如：pH是否合适，即不能离该蛋白的等电点太近；盐浓度是否合适，高盐易导致沉淀；温度是否合适，过高或过低温度都有可能造成沉淀；溶液中是否含金属离子，蛋白在碱性条件下易与金属离子形成沉淀；缓冲液中是否含有有机溶剂，有机溶剂会降低水的介电常数，导致蛋白脱水相互聚集而析出。蛋白沉淀类推因此，对于Ni柱纯化蛋白发生沉淀的现象，我们也可以从这几个方面考虑。1、和蛋白本身的性质有关，有些蛋白本身比较脆弱，在纯化分离的过程中易遭受损伤，例如热损伤而导致聚集沉淀；有些蛋白需要辅助因子或辅蛋白的存在才能存活；2、对于Ni柱，纯化的过程中金属离子镍离子的脱落会造成与蛋白结合，使其聚集而沉淀；3、蛋白所处的缓冲液环境，如洗脱时的pH、盐浓度、温度等，不合适都会造成蛋白沉淀；解决针对这些可能出现的原因，我们的应对措施如下。1、若和蛋白性质有关，必要时操作小心谨慎，避免不必要因素导致的机械损伤；其次根据文献报道或蛋白性质适当添加一些保护蛋白或辅因子；2、若和Ni柱上镍离子的脱落有关，则纯化过程中适当添加一些低浓度的EDTA，螯合掉镍离子，避免金属离子和蛋白相互作用导致沉淀；3、摸索适合该蛋白纯化分离的缓冲液，如pH、盐离子浓度、温度等条件。消息来源：知乎郑重声明：本文版权归原作者所有，转载文章仅为传播更多信息之目的，如作者信息标记有误，请联系我们修改或删除，多谢。

各位小伙伴们，我们又见面了好久没有更新一些技术性的文章了，今天我们就来讲讲蛋白质技术，对，没错，就是Western免疫印迹，这个实验相信各位小伙伴们，也是耳熟能详了，但是呢，还是有不少下伙伴们在实验过程中，会出现各种各样的问题，所以为了解惑各位小伙伴们，今天我们就出一期关于Western免疫印迹实验的知识点，其中包括它的概念、原理、应用场景、操作步骤以及注意事项等。Western免疫印迹是什么Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western免疫印迹原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。Western免疫印迹应用场景#1■  从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；#2■  定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；#3■  用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。Western免疫印迹操作步骤Western操作步骤一共分为八大步骤，在这里呢，我就简单向大家介绍大致的步骤，为了出于严谨性，我们将在下一期为大家专门介绍操作步骤的详细介绍。八大步骤：一、试剂的准备二、蛋白样品制备三、 蛋白含量的测定四、SDS－PAGE电泳五、转膜六、免疫反应七、化学发光，显影，定影八、凝胶图象分析Western免疫印迹注意事项 1.  一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。2.  显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。3.  DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细

细胞因子受体的结构和分类根据细胞因子受体cDNA序列以及受体胞膜外区氨基酸序列的同源性和结构征，可将细胞因子受体主要分为四种类型：免疫球蛋白超家族（IGSF）、造血细胞因子受体超家族、神经生长因子受体超家族和趋化因子受体。此外，还有些细胞因子受体的结构尚未完全搞清，如IL-10R、IL-12R等；有的细胞因子受体结构虽已搞清，但尚未归类，如IL-2Rα链（CD25）。（一）免疫球蛋白超家族该家族成员胞膜外部分均具有一个或数个免疫球蛋白（Ig）样结构域，有关Ig超家族的结构特点参见第三章。目前已知，属于IGSF成员的细胞因子受体的IL-1Rt I（CD121a）、IL-1RtⅡ（CD121b）、IL-6Rα链（CD126）、gp130(CDw130)、G-CSFR、M-CSFR（CD115）、SCFR（CD117）和PDGFR，并可分为几种不同的结构类型，不同IGSF结构类型的受体其信号转导途径也有差别。（1）M-CSFR、SCFR和PDGFR：胞膜外区均含有5个Ig样结构域，其中靠近胞膜区为1个V样结构，其余4个为C2样结构。受体通常以二聚体形式与相应的同源二聚体配体结合。受体胞浆区本身含有蛋白酷氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）结构。（2）IL-1Rt I和IL-1RtⅡ：胞膜外区均含有3个C2样结构，受体胞浆区丝氨酸/苏氨酸磷酸化可能与受体介导的信号转导有关。（3）IL-6Rα链、gp130以及G-CSFR：胞膜外区N端 均含1个C2样区，在靠近胞膜侧各有1个红细胞生成素受体超家族结构域，此外在胞有胞膜外区还含有2～4个纤粘连素结构域。gp130胞浆区酷氨酸磷酸化与信号转导有关。这种结构类型的受体其相应配体IL-6、OSM、LIF和G-CSF在氨基酸序列和分子结构上也有很大的相似性。

细胞因子受体细胞因子是由多种细胞产生的，具有广泛调节细胞功能作用的多肽分子，细胞因子不仅作用于免疫系统和造血系统，还广泛作用于神经、内分泌系统，对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用。细胞因子发挥广泛多样的生物学功能是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部。因此，了解细胞因子受体的结构和功能对于深入研究细胞因子的生物学功能是必不可少的。随着对细胞因子受体的深入研究，发现了细胞因子受体不同亚单位中有共享链现象，这对阐明众多细胞因子生物学活性的相似性和差异性从受体水平上提供了依据。绝大多数细胞因子受体存在着可溶性形式，掌握可溶性细胞因子受体产生的规律及其生理和病理意义，必将扩展人们对细胞因子网络作用的认识。检测细胞因子及其受体的水平已成为基础和临床免疫学研究中的一个重要的方面。

核酸标记技术检测法通过核酸标记技术可将细胞因子cDNA作为基因探钊检测细胞内细胞因子基因组DNA或mRNA。主要有以下几种方法：1.应用同位素（或非同位素）标记的cDNA探针，检测经Northernblot后细胞因子mRNA水平或采用打点杂交法。2.应用标记cDNA探钊与细胞或组织切片进行原位杂交，然后进行放射自显影。3.细胞因子mRNA经反转录为cDNA，用特异性细胞因子引物经聚合酶链反应（PCR）扩增细胞因子cDNA,Southern blot后用标记探针检测特异细胞因子DNA水平。

根据我司关于2019年部分节假日安排的通知，9月13日中秋节放假，与周末连休。