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超高纯度纯化单克隆抗体——使用疏水层析填料纯化

默隆实业

2022/08/30 08:59

阅读：82

屏幕截图 2022-08-29 102424.jpg

在抗体药物生产的下游工艺中，一般会在捕获阶段（Protein A亲和层析）之后的精制步骤中，采用两种不同分离模式的层析法进行纯化。疏水层析（HIC）是能有效去除多聚体等杂质的分离模式。

I. R. A. P. Bresolin, N. Lingg, I. T. L. Bresolin and A. Jungbauer

Hydrophobic interaction chromatography as polishing step enables obtaining ultra-pure recombinant antibodies

J. Biotechnology: X6 (2020) 100020, https://doi.org/10.1016/j.btecx.2020.100020

（要点）

·在精制步骤中使用HIC填料TOYOPEARL Phenyl-650M，分离纯化出了超高纯度的抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）。

·对HIC模式下的吸附等温线、穿透曲线、层析分离等实施了评估。

·通过HIC纯化的抗体的纯度是99.9%，回收率是96.2%。并且确认到，抗体组分中混入的多聚体杂质、宿主细胞蛋白（HCP）、DNA都在检验要求范围之内。

·在需要制备超高纯度的抗体时，可在下游纯化工艺中使用该HIC分离法。

● 抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）的纯化

样品：抗肿瘤坏死因子抗体（anti-tumor necrosis factor alpha：TNFa、IgG₁）

参照抗体：阿达木单抗 (Adalimumab，商品名：Humira^® )

动态吸附载量（TOYOPEARL Phenyl-650M）：12.05 g/L

色谱柱尺寸：5 mm I.D. × 2.55 cm、驻留时间：2.5 min（流速：0.2 mL/min）

洗脱溶液：20 mmol/L磷酸钠缓冲溶液（pH 7.4）＋ 1 mol/L 硫酸铵

多聚体的分析、定量：TSKgel^® G3000SWXL

● 使用疏水填料TOYOPEARL Phenyl-650M对抗体进行超高纯度纯化

（分离出的抗体洗脱峰1和洗脱峰2的纯度测定，请继续阅读下一页）

●
对疏水层析（HIC）纯化后的抗体（Peak 1）进行纯度测定

样品	浓度 (g/L)^a	抗体纯度 (%)^b	多聚体 (%)^c	HCP (ppm)^d	dsDNA (ppb)^e
anti-TNFa IgG1（纯化前）	2.00	98.04	1.53	342.5	＜ 0.41^*
anti-TNFa IgG1 + salt（添加样品）	2.00	98.31	1.55	173.7	＜ 0.41^*
Peak 1（纯化组分）	0.96	99.90	＜ 0.06^*	＜ 2.0^*	＜ 0.85^*
Peak 2	0.03	59.88	57.55	＜ 63^*	＜ 27^*
Adalimumab (Humira)	2.00	99.56	0.33	n.d. (181.6)^**	＜ 0.41^*

^a by UV at 280 nm, ^b by SEC at 280 nm, ^c by SEC at 215 nm, ^d ELISA, ^e PCR resDNASEQ^®

* Below lower limit of detection (LLOD), undiluted sample used

** Data from LC/MS/MS by Oliviero et al., Easy, Fast and Reproducible Analysis of Host Cell Protein (HCP) in Monoclonal Antibody Preparations, Application Note (2019)

Ref.: I. R. A. P. Bresolin et al., J. Biotechnology: X6 (2020) 100020, https://doi.org/10.1016/j.btecx.2020.100020, data modified from original

※通过HIC，获得了比市售抗体药物阿达木单抗更高纯度的抗体组分。

● 抗体纯化时HIC填料选择的要点

·根据抗体的疏水性，选择疏水性适度的HIC填料（官能团、细孔径、粒径等参数的不同），优化抗体的回收率和分离选择性（去除杂质）

·优化分离时的洗脱条件（缓冲液浓度、pH、盐浓度、流速、梯度的倾斜度、温度等）

·设置稳定的线性梯度洗脱条件，使抗体在梯度的中间部分洗脱出来

·HIC填料的疏水性：（低） Ether-650/PPG-600 < Phenyl-650/600 < Butyl-650/600 < Hexyl-650 （高）

● HIC填料和筛选用预装柱产品一览表

货号产品名称粒径(mm)规格*(mL)备注0016173TOYOPEARL Ether-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021302TOYOPEARL PPG-600M40 - 90100散装填料（瓶）0014478TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021888TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 90100散装填料（瓶）0007477TOYOPEARL Butyl-650M40 - 90100散装填料（瓶）0021449TOYOPEARL Butyl-600M40 - 90100散装填料（瓶）0019956TOYOPEARL SuperButyl-550C50 - 150100散装填料（瓶）0019026TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 150100散装填料（瓶）0043276TSKgel Ether-5PW (20)15 - 2525散装填料（瓶）0043176TSKgel Ether-5PW (30)20 - 4025散装填料（瓶）0043277TSKgel Phenyl-5PW (20)15 - 2525散装填料（瓶）0043177TSKgel Phenyl-5PW (30)20 - 4025散装填料（瓶）

货号产品名称粒径(mm)规格(mL)备注0045220SkillPak TOYOPEARL Ether-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045218SkillPak TOYOPEARL PPG-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045217SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045216SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045215SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M40 - 901 mL×5支预装柱0045214SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M40 - 901 mL×5支预装柱0045219SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 1501 mL×5支预装柱0045233SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M,PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)-1 mL×5种×1支预装柱0045234SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M,PPG-600M, Hexyl-650C, Ether-650M)-1 mL×5种×1支预装柱0045235SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-650M, Phenyl-650M, PPG-600M)-1 mL×3种×2支预装柱0045236SkillPak HIC(TOYOPEARL Butyl-600M, Phenyl-600M, PPG-600M)-1 mL×3种×2支预装柱0045237SkillPak HIC(TOYOPEARL Phenyl-650M, PPG-600M, Hexyl-650C)-1 mL×3种×2支预装柱0045238SkillPak HIC(TOYOPEARL Phenyl-600M, PPG-600M, Hexyl-650C)-1 mL×3种×2支色谱柱0045256SkillPak TOYOPEARL Ether-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045254SkillPak TOYOPEARL PPG-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045253SkillPak TOYOPEARL Phenyl-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045252SkillPak TOYOPEARL Phenyl-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045251SkillPak TOYOPEARL Butyl-650M40 - 905 mL×1支预装柱0045250SkillPak TOYOPEARL Butyl-600M40 - 905 mL×1支预装柱0045255SkillPak TOYOPEARL Hexyl-650C50 - 1505 mL×1支预装柱

*不同级别的填料中，有不同粒径和不同包装规格的产品。

SkillPak分为1 mL色谱柱（7 mm I.D.×2.5 cm）和5 mL色谱柱（8 mm I.D.×10 cm）。

1 mL型号：进口：使用“货号0017955 拉紧螺栓型（带堵头）”，不可使用“货号0016566 便携式接头·1/16"（PEEK）”。

出口：可直接连接内螺纹接头，连接外螺纹接头时需使用管套（“货号0017898 拉紧螺栓型管套”）等配件。

5 mL型号：进口和出口：使用“货号0016566 便携式接头·1/16"”或“货号0017955 拉紧螺栓型（带包头）”。

SkillPak预装柱产品资讯

Protein L亲和填料和筛选用预装柱产品