一个“金牌”元件出马，载体“更高更快更强大”

载体构建中的挑战-低转染效率

目的基因随机整合到异染色质和启动子DNA的甲基化是抑制基因表达的主要机制。在生物制药过程中，稳定和高水平的目的转基因表达是快速筛选单克隆细胞的基础，因此迫切需要我们发现一种或多种基因调控元件，它 们可以有效防止基因沉默，并使目的基因在细胞内长时间保持高水平表达。染色质修饰元件（chromatin-modifying elements）

促进转基因转录的染色质调控元件（chromatin-modifying elements）可大致分为以下两类：

（1）作为边界或边界元件限制异染色质标记扩散到常染色质区域，包括绝缘子（Insulator）、支架/基质附着区（scaffold/matrix attachment region, S/MAR）和稳定抗阻遏元件（stabilising anti-repressor element, STAR）；

（2）通过显性染色质重塑机制发挥积极调控作用的元件，包括基因座位控制区（locus control region, LCR）和泛染色质开放元件（ubiquitous chromatin opening elements, UCOE）。

绝缘子可分为两大类：增强子阻遏绝缘子和屏障绝缘子，存在于开放染色质（常染色质）和封闭染色质（异染色质）之间，能阻止因临近的异染色质传递而造成的位置效应差异。最常用的绝缘子是cHS4，它对红系鸡细胞、人红白血病K562细胞系和转基因小鼠非常有效，但对CHO细胞的作用比较有限。

S/MAR具有AT富集区域，能够促进染色质环状结构的形成，作为DNA复制的起点调节基因转录，并且与绝缘子一样，也可以阻止异染色质标记扩散到常染色质区，从而抵抗基因沉默，促进外源基因稳定表达。但只有全长MAR片段（约3 kb）能够增加转基因的表达水平和稳定性，并且MAR的作用弱于UCOE。MAR体积大，并且其作用机制尚未完全清楚，这使得MAR在操控上不可预测，但进一步的研究肯定会有助于更好地理解MAR。因此，MAR目前仍然以科学研究为主，并未在工业生产上广泛应用。

通过从500 bp-2.1 kb的人类基因组片段中随机筛选，确认STAR能够抵消染色质相关抑制因子的负面影响。STAR7和STAR40显示出类似的抗阻遏“强度”，在人类和CHO-K1细胞中都是活跃的，并赋予更高数量的阳性菌落和拷贝数依赖的报告蛋白表达。然而另一项研究显示STAR40在CHO细胞中活性有限。STAR元件对细胞存活和转基因表达产生的促进作用很小，尤其是对无血清悬浮液生长的细胞影响更有限。虽然早期研究发现STAR的抗阻遏作用似乎非常有效且有希望，但该系统在工业用途尚未全面发展。

LCR是一种具有显性染色质重塑功能的转录调控元件，包含一系列DNA酶I超敏位点以及高密度转录因子结合位点，能够进行染色质重构进而建立可转录的开放染色质区，并且它还能阻止异源染色质扩散，防止位置效应转变，但LCR是组织特异性的，只能在一定条件下发挥作用，限制了其广泛使用。

UCOE®是一种具有显性染色质重塑功能的DNA结构域，能够使插入任何染色质位点的DNA进入转录活跃的“开放”状态，但它是组织非特异性的，并且不包含LCR特有的多个DNase I超敏位点，也不需要同时在5′和3′端侧翼插入转基因以发挥其功能（如绝缘体和S/MAR），因此具备商业应用价值。

UCOE®在生物制药领域中的应用

UCOE®的发现：

染色质（染色体）是细胞遗传物质存在的形式，按其形态特征和活性状态分为两类：常染色质和异染色质。常染色质折叠压缩程度低，相对伸展，不易被甲基化，处于转录活跃的状态；异染色质折叠压缩程度高，处于聚集状态，容易被甲基化，没有基因转录活性。外源基因整合入常染色质是基因转录的必要条件，然而细胞中大部分是异染色质，这就导致外源基因的无效整合。前面小默提到的UCOE®，其结构特点与功能完美的解决了因位置效应引起的基因沉默。

看家基因是维持细胞最低限度功能必不可少的基因，如组蛋白基因、核糖体基因及糖酵解酶基因等等，这类基因几乎在所有类型细胞中都表达，是维持细胞基本结构和代谢功能的基础。如前所述，UCOE®正是发现于看家基因启动子附近，并且大多处于两个基因之间，序列横跨两个差异启动子，包含CpG岛结构域，具有开放染色质和防止DNA甲基化的功能，正是因为UCOE®的这种功能才能保证看家基因持续稳定的表达。利用UCOE®的这种特性，将其应用于转基因表达载体，能够显著降低转基因的表观遗传沉默，提高其表达和稳定性，实现转基因的有效整合。

UCOE®作用机制：

普通质粒携带转基因随机整合入基因组，当其整合位点刚好在常染色质，则转录激活；而当其整合在异染色质，则处于封闭状态，发生转录沉默。将UCOE®元件置于转基因开放阅读框之前形成基于UCOE®的质粒，当UCOE®质粒随机整合入基因组，不管是在常染色质还是异染色质，UCOE®都能打开转基因附近的染色质使其处于开放状态，同时防止启动子的DNA甲基化沉默，从而促进转录活性，使转基因持续稳定的表达。

UCOE应用案例：

【案例】早在2002年，科学家就发现A2UCOE能够调控转基因在无血清悬浮生长的CHOS细胞中快速表达，A2UCOE通过增加重组蛋白的拷贝数促进表达，并且显著缩小了细胞间的表达差异[4-5]。在CHO-S细胞中，与使用标准hCMV启动子相比，添加4 kb的A2UCOE序列能够显著提高抗体整体表达水平，并且稳定高表达克隆明显增多，在1L反应器中蛋白生产水平也明显优于对照[6]。将基于A2UCOE的系统与市售免疫球蛋白表达载体（pFUSE）进行比较，转染无血清CHO细胞，以确定人源化抗C2单克隆抗体的重链和轻链的表达水平和稳定性，发现基于UCOE®的载体能够产生大量稳定克隆，重组抗体表达水平也显著提高[7]。

【案例】从初始转染到鉴定和培养高水平表达转基因的克隆细胞群的时间是重组抗体生产的限速步骤。研究人员使用3kb Rps3 UCOE和8kb A2UCOE与表达IgG-1和IgG-4轻重链的启动子连接，开发了一种用于早期细胞系发育和悬浮CHO细胞克隆分离的快速方法，使用基于UCOE®的载体与ClonePix筛选相结合，使研究人员仅在四周内就从转染筛选获得高表达克隆[8]。使用UCOE®载体在CHO细胞中稳定表达EGFP和促红细胞生成素（EPO）能够改善细胞生长和存活率，并保持稳定的蛋白表达[9-10]。与不含UCOE®的载体相比，使用UCOE®有效降低了染色体重排，并且在长期培养中维持染色体位点整合的同质性[11]。

【案例】为了确定生产单克隆抗体最有效的染色质修饰元件，研究人员将核心1.5 kb的A2UCOE亚片段与一系列边界型基因调控元件进行了比较，这些元件定位于由hCMV启动子驱动的重链和轻链抗体转录单元的不同位置，在稳定转染CHOK1和阳性选择细胞池后，与S/MAR、cHS4和STAR载体相比，含有A2UCOE的载体使抗体表达增加六倍以上，细胞传代（120代）稳定性良好，并且还显著降低了转基因启动子DNA甲基化数量，有助于维持起始表达水平。这些结果说明，UCOE®是该单克隆抗体表达系统中效用最高的元件[12]。

默克工艺解决方案

自2002年发现UCOE®至今刚好20年，UCOE®的结构特点及其作用机制已被科学家研究的非常清晰，很多数据证明UCOE®是目前应用于工业生产最优的染色质重塑元件，其优势不言而喻。Merck Millipore拥有UCOE®全球独家专利技术，并向全球提供含有UCOE®元件的即用型质粒，该UCOE®质粒与CHOZN® CHO GS-/-细胞系配套使用，能够有效提高外源蛋白表达并增加高表达克隆的比例，大大降低筛选通量，节约人力物力成本。

CHOZN-UCOE®应用案例分享

目前国内已有多家企业使用默克的CHOZN®-UCOE®表达系统，并买断了CHOZN®-UCOE®的商业化授权，可以不限分子不限年限使用该表达体系，并且不会发生知识产权纠纷。已有客户使用该表达系统进行了上市申请，得到了监管机构的完全认可。

案例1：

将两个UCOE®元件分别置于抗体重链和轻链启动子前构建UCOE®质粒，在96孔板中通过数百组的Mini-pool评估了UCOE®所带的益处。与非UCOE®质粒相比，UCOE®的使用能够大大提高高表达克隆的形成率，进而能够很大程度上节约我们获得高表达克隆的时间。更多数据请点击CHOZN®&UCOE®组合平台 SAFC®工艺解决方案。

案例2：

UCOE®应用于单抗、双抗、EPO蛋白的表达。

案例3：

CHOZN®-UCOE®的补料优化案例。图8总结了来自另一个IgG细胞系开发项目(mAb03)的三个克隆的单一补料优化结果，使用EX-CELL® Advanced CHO Feed 1和Cellvento® 4Feed补料混合生成。克隆偏好不同的补料混合物，克隆的表现提高原因也不同。例如，克隆D更喜欢单一的4Feed，而克隆E更喜欢50：50的混合补料；克隆F更喜欢50：50和75%的Feed混合补料（75：25）。在机制方面，克隆D和克隆E显示出活细胞密度的提高，导致滴度更高；对于克隆F，Qp有所提高。

案例4：

CHOZN®-UCOE®表达系统的反应器放大性良好。

参考文献

[1] Romanova N ,  Noll T . Engineered and Natural Promoters and Chromatin‐Modifying Elements for Recombinant Protein Expression in CHO Cells[J]. Biotechnology Journal, 2017:1700232.

[2] Antoniou M ,  Harland L ,  Mustoe T , et al. Transgenes encompassing dual-promoter CpG islands from the human TBP and HNRPA2B1 loci are resistant to heterochromatin-mediated silencing[J]. Genomics, 2003, 82(3):269-279.

[3] A J J N ,  B J O ,  B K M , et al. Ubiquitous Chromatin-opening Elements (UCOEs): Applications in biomanufacturing and gene therapy[J]. Biotechnology Advances, 2017, 35( 5):557-564.

[4] Benton T ,  Chen T ,  Mcentee M , et al. The use of UCOE vectors in combination with a preadapted serum free, suspension cell line allows for rapid production of large quantities of protein[J]. Cytotechnology, 2002, 38(1-3):43-46.

[5] Betts Z ,  Dickson A J . Assessment of UCOE on Recombinant EPO Production and Expression Stability in Amplified Chinese Hamster Ovary Cells[J]. Molecular Biotechnology, 2015, 57(9):846-858.

[6] Boscolo S ,  Mion F ,  Licciulli M , et al. Simple scale-up of recombinant antibody production using an UCOE containing vector.[J]. New Biotechnology, 2012, 29(4):477-484.

[7] Dharshanan S ,  Chong H ,  Cheah S H , et al. Stable expression of H1C2 monoclonal antibody in NS0 and CHO cells using pFUSE and UCOE expression system[J]. Cytotechnology, 2013, 66(4):625-633.

[8] Hou J ,  Hughes B S ,  Smede M , et al. High-throughput ClonePix FL analysis of mAb-expressing clones using the UCOE expression system.[J]. N Biotechnol, 2014, 31(3):214-220.

[9] Betts Z ,  Dickson A J . Assessment of UCOE on Recombinant EPO Production and Expression Stability in Amplified Chinese Hamster Ovary Cells[J]. Molecular Biotechnology, 2015, 57(9):846-858.

[10] Betts Z ,  Croxford A S ,  Dickson A J . Evaluating the interaction between UCOE and DHFR-linked amplification and stability of recombinant protein expression[J]. Biotechnology Progress, 2015, 31(4).

[11] Betts Z ,  Dickson A J . Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification[J]. Biotechnology Journal, 2016, 11(4):554-564.

[12] Fay S ,  Berni S ,  Antoniou M N , et al. Chromatin Function Modifying Elements in an Industrial Antibody Production Platform - Comparison of UCOE, MAR, STAR and cHS4 Elements[J]. Plos One, 2015, 10(4):e0120096.

[13] Rocha-Pizaa M D R ,  Ascencio-Favela G , BM Soto-García, et al. Evaluation of changes in promoters, use of UCOES and chain order to improve the antibody production in CHO cells[J]. Protein Expression and Purification, 2017, 132:108-115.

[14] Zhang F ,  Thornhill S I ,  Howe S J , et al. Lentiviral vectors containing an enhancer-less ubiquitously acting chromatin opening element (UCOE) provide highly reproducible and stable transgene expression in hematopoietic cells[J]. Blood, 2007, 110(5):1448-1457.

[15] D  Niraja,  Maroun K ,  Citra M , et al. Long-Term Reproducible Expression in Human Fetal Liver Hematopoietic Stem Cells with a UCOE-Based Lentiviral Vector[J]. PLoS ONE,9,8(2014-8-12), 2014, 9(8):e104805.

[16] Vincent Y C K ,  Sonia F ,  Simon N W , et al. Haemophilia B Curative FIX Production from a Low Dose UCOE-based Lentiviral Vector Following Hepatic Pre-natal Delivery[J]. Current Gene Therapy, 2016, 16(4):-.