借助puriFlash PrepLC与expression® CMS质谱在线联用，进行生物活性肽纯化

应用案例|借助puriFlash®5.250 PrepLC与expression® CMS质谱在线联用系统，进行生物活性肽的纯化

        近年来，越来越多的生物制药公司开始研发基于肽/蛋白类的药物，因为与传统的小分子药物相比，它们具有更高的特异性和选择性。而在药物发现过程中，达到生物活性目标化合物的纯度水平对于确保最终产品的安全性和有效性至关重要。

        乳清分离蛋白是奶酪生产的副产物，含有多种糖蛋白和两种重要的生物活性肽:分子量为 6757 Da的酪蛋白巨肽A （CMPa）和分子量为 6787 Da的酪蛋白巨肽B （CMPb）。提取和纯化酪蛋白巨肽，对于研究其生物活性是至关重要。

        我们以乳清分离蛋白和两种酪蛋白巨肽为例，借助puriFlash®5.250 PrepLC与 expression®CMS 质谱组成的在线联用系统进行生物活性成分的分离和纯化。与传统的检测器（如UV或ELSD）相比，这种组合提供了更高的选择性和灵敏度。

•将从当地杂货店购买的 50g 乳清分离蛋白样品用 500mL 溶剂溶解 （70% 水+ 30% 甲醇（v/v））。在70°C下超声90min，然后在减压下过滤。

•在40°C的减压条件下，使用旋转蒸发器去除甲醇，将所得滤液浓缩至300 mL。在4℃下保存1小时。加入等量的冷乙醇搅拌5min后，在4℃下再保存4小时。

•使用0.5µm过滤器在减压下过滤混合物，最后的滤液浓缩到50ml。

•取100µL浓缩提取物与900µL去离子水混合，进行HPLC/CMS分析。

•剩余滤液使用puriFlash®5.250 PrepLC和expression®CMS质谱系统进行纯化。

        使用AVANT®HPLC/CMS系统进行乳清分离蛋白提取物分析（表1）。

        图1a为提取液的HPLC/CMS图谱。6.44 min的总离子流图显示，该化合物是一个多电荷肽，分别为755.2、849.4、970.6、1132.1和1358.6（图1b），形成一个电荷谱图。通过软件电荷反卷积功能，确定肽的不带电质量为6787.4 Da，为酪蛋白巨肽B （CMPb，理论质量为6787 Da）。

        图2a为提取液的HPLC/CMS图谱，2b是RT 11.02 min时的总离子流图，2c是RT 11.02 min时肽不带电荷的质量。

        将分析方法放大至制备规模，色谱柱从4.6 mm ID放大至30 mm ID，并在puriFlash®5.250 PrepLC/Flash系统上进一步优化纯化两种CMPs（酪蛋白糖巨肽），与expression®CMS质谱系统在线联用进一步进行馏分确认。

        乳清分离蛋白的PrepLC-UV/MS色谱图见图3，参数见表2。

        基于CMS质谱信号触发馏分采集，MS信号具有较高的选择性和灵敏度。970 - 971 Da的XIC提取离子流图检测CMPb, 965 - 966 Da的XIC提取离子流图检测CMPa。

        使用旋转蒸发器除去馏分11-17和馏分18-22中的有机溶剂，剩余的水溶液使用LABCONCO Freezone 2.5L（-50℃）冻干机干燥，得到各10 mg的干样，然后溶解在10 ml 去离子水中进行后续的 HPLC/UV/MS 分析。纯度分析结果如图 4 所示。

        混合馏分11-17的CMPb纯度分析如图4所示。质谱分析显示，在m/z为970.8、1132.3、1358.6和1968.2时检测到四种主要离子（图4b）。

        根据图4b的质谱图信息，确定5.94 min时峰的未带电质量为6788.4 （CMPb，图4c）。同时，质谱也检测到6758.3 Da，6773.5 Da，6804.8 Da和6868.4 Da四个次要成分。

        图4d显示CMPb纯度为86.7%，但根据MS数据，化合物纯度实际上低于此值（估计为80%）。

        图4 a：11-17混合馏分的HPLC-MS图谱；4b：在RT 5.94 min时的质谱图信息；4c：不带电质谱图数据；4d：11-17混合馏分的HPLC-UV图谱。

        根据HPLC-UV的结果，混合馏分18-22中的CMPa测量为94.7%（图5a）。

        反卷积计算出CMPa不带电主要成分为6756.2 Da（图5b），一个次要成分为6774.6 Da，是CMPa的氧化形式。经确认，最终的总纯度估计约为90%，对于药物发现中的生物活性分子具有极好的价值。

        图5a: 18-22混合馏分的HPLC-UV色谱图。5b：CMPa的反卷积不带电质谱图。

  puriFlash®5.250 PrepLC/Flash系统与expression®CMS质谱在线联用，实现了卓越的性能，促进了复杂基质中生物活性大肽的选择性纯化。与UV或ELSD检测器相比，质谱仪具有更好的选择性和灵敏度。

        通过该方法成功分离酪蛋白糖巨肽，馏分获得的纯度范围为80% (CMPb)-90% (CMPa)，收率高。

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