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药物疫苗中蛋白检测的TN分析法

德国耶拿

2021/07/27 13:31

阅读:62

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背景介绍

在药物疫苗生产中,需要对起始、中间和最终产品的抗原水平进行控制。用以检测衰减失活的病毒或细菌数量。由于这些抗原通常由蛋白质组成,总蛋白的分析定量是一种可选方法。

《药典》规定了许多相关方法,其中包括几种紫外/可见分光光度法(如Lowry法、Bradford法、BCA法)以及两种总氮法,即凯氏定氮法和催化燃烧法。本应用说明重点介绍了欧洲药典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃烧法氮化合物在氧气中高温裂解为一氧化氮(NO),然后通过化学发光检测器(CLD)进行检测。此方法描述几乎与EN 12260一致,后者描述了环境水中TNb的测定 multi N/C分析仪既是如此设计,因此也可用于医药产品中TNb的测定。TNb可以转化为总蛋白来确定抗原的水平。

由于蛋白质的含氮量不同,根据以下公式乘以系数6.25,将总氮浓度转换为总蛋白质浓度已被广泛接受:

C [总蛋白] = c [TN] x 6.25  


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仪器

1: 分析仪说明:multi N/C 2100S

1627363612(1).jpg


样品和试剂

在客户现场制备的5个尿素TNb校准标准1个BSA对照标准品和3个未知客户样品,测定三次。分析前,样品在4下制冷剂中保存。

恢复至室温室后,用微量移液管将液体样品直接转移到2毫升样品瓶中,并盖上瓶盖。自动进样器取样75μL样品直接注射进燃烧炉中。在铂催化剂的作用下,所有氮化合物在纯氧环境中通过高温燃烧催化转化为一氧化氮(NO随后化学发光检测器(CLD)定量检测NO

测样顺序、自动搅拌及洗针设置均由AS60自动进样器控制完成。

 

 

校正

BSA蛋白质标准溶液配置5  60 mg/L系列总氮(TNb)多点校准标样200mg TN/L BSA储备溶液(Sigma Art.Nr. A-7906,白蛋白,牛含量为15.60%,纯度为98%),128.2mg,用超纯水定容至100mL此类样品中从测定的氮含量计算蛋白质浓度的标准转换因子(在文献中找到)6.25



image.png

1:TN示例  BSA校正曲线和特征范围5-60mg/L N



结果和讨论

每个样品至少测定三次。

3: 方法设置

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结论

所有样品都得到了很好的重复性,RSD值很低。

采用微量注射器进样,从样品瓶到燃烧炉的距离短,直接注射无传输管路和阀门。样品消耗量极少,3次润洗,5次75μL重复测试,样品消耗总体积不超过1.5mL。

配置CLD检测器的multi N/C分析仪是进行总氮测定的分析系统,遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B。客户的校准标准品和检查标准(BSA)的回收率佳,样品峰型多次测量均无偏移重复性好,且无拖尾,充分证明了仪器性能。



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