近年来,蛋白质组学在质谱技术的驱动下得以快速发展。特别是随着离子淌度技术成功的应用,为蛋白质组学发展带来了飞跃性的突破,随着4D-蛋白质组学技术横空出世,各个领域的专家学者取得了丰硕的成果。但是基于质谱技术的蛋白质组学研究仍面临严峻的挑战,如面对大队列样本的分析中,如何保证数据的高度重复性以及完整性,仍是亟待解决的问题。
01
传统DIA技术与DDA技术的优势与不足
目前蛋白质组学主流的数据采集模式是DDA(Data-dependent Acquisition,数据依赖采集模式)以及DIA(Data-independent Acquisition,数据非依赖采集模式)。在DDA中,仪器根据扫描的一级谱图MS1中各个离子信号强度进行排序,选择强度在前N名的母离子进行二级碎裂。但是这种方式的缺点是高丰度组分严重影响检测结果、特别是对大队列样本的检测重复性差。DIA技术是将质谱全扫范围分为若干个窗口,能够将每一个预设的隔离m/z窗口中的每一个母离子都进行二级碎裂,获得碎片信息,因此数据利用率大大提高,缺失值减少。传统的DIA技术虽然能够全面的扫描样本离子信息,但是谱图十分复杂,让谱图的解析成为了另外一个挑战。虽然可以通过设置更窄的隔离窗口降低谱图的复杂度,但是对应的隔离窗口数目会变多,从而导致DIA扫描的循环时间变长。同时,由于一个前体离子在一个循环时间内仅被扫描一次,所以离子的整体利用率会下降。
02
dia-PASEF技术的诞生
为了弥补传统DIA技术的不足,在Matthias Mann教授及Ruedi Aebersold教授等多个团队的强强联手下,基于TIMS(捕集离子淌度谱,Trapped Ion Mobility Spectrometry)+PASEF®(平行累积连续碎裂,Parallel Accumulation Serial Fragmentation)数据采集模式的dia-PASEF®技术应运而生,并于2020年11月在Nat Methods上发表了题为“diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition“文章。
03
dia-PASEF技术原理
dia-PASEF®技术将PASEF®扫描速度和灵敏度的优势应用于DIA技术。PASEF®累积离子的同时,对离子在淌度维度进行分离,并且离子在淌度池中的迁移速率与离子本身的m/z呈现很好的线性相关性。所以在dia-PASEF®技术中,首先是母离子在第一根淌度管中累积,然后在第二根淌度管中进行淌度分离,与此同时,DIA技术设置的隔离m/z窗口刚好与肽段的离子迁移率匹配,因此可以保证几乎所有离子都能被碎裂检测(见图2)。
将dia-PASEF®技术与传统DIA和DDA技术比较,分别使用三种方法检测等量的样本,结果表明,dia-PASEF®技术通过超快的扫描速度,肽段在相同时间内被多次碎裂,使得dia-PASEF®产生的碎片离子峰强度远高于其它两种采集模式(图3a)。对比母离子离子流图进一步表明了dia-PASEF®技术能够有效地提高离子利用率,提升仪器的灵敏度(图3b和3c)。
04
dia-PASEF技术优势
一. 超高灵敏度
运用dia-PASEF®技术,仅需ng级别蛋白上样量,就可实现蛋白的深度覆盖。对不同上样量Hela样本(上样量分别为0.2ng、1ng、10ng、50ng、200ng),采用93min的液相梯度,300nL/min的流速,结合dia-PASEF®采集模式,使用DIA-NN进行数据分析。结果显示,上样量仅为0.2ng时,便能够鉴定到1741个蛋白,当上样量达到200ng时,可以达到接近9000的蛋白鉴定水平(图4a)。通过对比不同上样量数据重现性和稳定性,结果表明即使上样量为10ng,鉴定结果的CV值仅在7%左右(图4b)。显然,采用dia-PASEF®技术,即使在上样量很低的条件下,也能够达到超高的蛋白鉴定水平,同时能够保证数据的准确性,进一步凸显了dia-PASEF®技术高灵敏度的优势。
二. 高通量分析
当dia-PASEF®技术应用于高通量蛋白质组学时,依托4D平台超快扫描速度,短梯度下同样能够实现无与伦比的蛋白鉴定深度和数据完整度。布鲁克与Evosep公司合作,联合推出用于高通量蛋白质组学研究的整体解决方案。当使用5.6min梯度的Evosep色谱方法时,对应一天可以分析200例样本, 200ng Hela样本(200 SPD)蛋白平均鉴定量可以达到5420。同时,分析不同通量下的CV值,即使是在200 SPD的实验条件下,鉴定结果的平均CV值也低于8%,表明在高通量蛋白质组学分析中,dia-PASEF®技术依然可以保证定量的准确性和数据的完整度。上述结果表明, timsTOF Pro使用 dia-PASEF®采集模式能够在短梯度下实现更深度的蛋白覆盖,并且数据重复性好,使其非常适合大队列样本分析(图 5)。
三. 蛋白深度覆盖和数据完整性高
布鲁克质谱新品timsTOF HT,采用dia-PASEF®采集方法分析HYE蛋白混合标品(将Human、Yeast和E.Coli三个不同物种来源的蛋白酶解产物按照一定比例混合)。结果表明,使用25分钟梯度,仅需要100ng样品,单针平均鉴定可达11400个蛋白和116600条多肽。即使上样量为10ng,蛋白鉴定量仍然可超过8000,进一步突显了timsTOF HT联合dia-PASEF®方法的超高灵敏度(如图6A)。同时,dia-PASEF®技术具有高稳定性和高度重现性的特点,如图6B所示,相同样本5ng、10ng和100ng上样量之间可重复鉴定的蛋白数目为7065。通过分析6针100ng样本结果显示,99.4%(11204 Protein Groups)的蛋白能在所有样本中重复鉴定(如图6C)。
四. 定量准确性高,动态范围宽
对不同比例HYE蛋白混合样本(样品A:65% Human,15% Yeast,20% E.Coli,样品B:20% Human,15% Yeast,65%E.Coli)进行蛋白定量分析,结果显示不同上样量10ng、50ng、100ng下,两组样本中所有蛋白的定量比值与理论比值高度一致(图7A),且定量蛋白的动态范围达到5个数量级(图7B)。
综上所述, 基于timsTOF系列仪器的4D-蛋白质组学平台,增加了额外一维淌度分离,开发的dia-PASEF®技术相较于常规的DIA和DDA技术,其优点如下:
1. 双TIMS的协同工作结合PASEF®技术,使得dia-PASEF®实现了几乎100%的离子利用率,提升了检测灵敏度,使其非常适合微量样本分析;
2. 在不牺牲隔离窗口循环时间的同时,淌度分离可有效降低谱图复杂度和提升鉴定可靠性;
3. 仪器稳定性和超快扫描速度可以保证短梯度下的蛋白深度覆盖和数据重复性,使得dia-PASEF®更适合大队列样本分析。
相信dia-PASEF®技术凭借着独特的优势,将大大加快组学研究向临床应用转化,使其能够更好服务于精准医疗相关研究。
参考文献
1.Meier F, et al. diaPASEF: parallel accumulation–serial fragmentation combined with data-independent acquisition[J]. Nature Methods, 2020, 17(12):1229-1236.
2.Christina L , et al. Data-independent acquisition-based SWATH-MS for quantitative proteomics: a tutorial[J]. Molecular Systems Biology, 2018, 14(8):e8126.
3. Romano H, et al. Speeding up label-free quantitation of complex proteome samples using dia-PASEF, 1803363-lcms-201-dia-pasef-lfq-ebook
4.Vadim Demichev, et al. dia-PASEF data analysis using FragPipe and DIA-NN for deep proteomics of low sample amounts[J]. Nature Communications, 2022,13:3944
[来源:布鲁克·道尔顿(Bruker Daltonics)]
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