You Only Live Once|细胞领域投稿:liuld@instrument.com.cn
2022年4月4日,厦门大学颜晓梅团队在Journal of Extracellular Vesicles(IF=26)在线发表题为“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究论文,该研究通过纳米流式细胞仪 (nFCM) 可以检测直径小至 40 nm 的单个 EV 和 SYTO 16 染色后 200 bp 的单个 DNA 片段,用于研究单个囊泡处的 EV-DNA。
通过同时对单个颗粒进行侧向散射和荧光 (FL) 检测并结合酶处理,本研究表明:(1) 裸 DNA 或与非囊泡实体相关的 DNA 大量存在于由细胞培养物制备的 EV 样品中(超速离心培养基);(2) 单个 EVs 中 EV-DNA 的数量表现出很大的异质性,DNA 阳性 (DNA+) EVs 的数量在 30% 到 80% 之间变化,具体取决于细胞类型;(3) 外部 EV-DNA 主要定位在相对较小的 EVs 上(例如,HCT-15 细胞系<100 nm),外部 DNA+ EVs 的分泌可以通过抑制外泌体分泌途径显著减少;(4) 内部 EV-DNA 主要封装在相对较大的 EV 的管腔内(例如 HCT-15 细胞系为 80-200 nm);(5) 双链 DNA (dsDNA) 是外部和内部 EV-DNA 的主要形式;(6) EVs 中未发现组蛋白 (H3),EV-DNA 与组蛋白不相关,(7) 基因毒性药物诱导 DNA+ EVs 的释放增加,外部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的数量以及单个EVs中的DNA含量均显着增加。这项研究为深入了解 DNA 与EV的关联提供了直接和确凿的实验证据。
细胞外囊泡 (EVs) 是由几乎所有细胞类型分泌的纳米级膜囊泡,通过将蛋白质、核酸和脂质从供体细胞转移到受体细胞来介导细胞间通讯。最近的研究表明,EV中存在基因组 DNA、线粒体 DNA 甚至病毒 DNA。通过 DNA 的包装和水平转移,EV 在维持细胞稳态、调节免疫反应和调节肿瘤进展方面发挥着至关重要的作用。
最近,基于 EV 中的 DNA (EV-DNA) 开发了用于肿瘤诊断的液体活检测试。尽管已经认识到 EV-DNA 的生物学意义,但对 EV-DNA 的探索较少,许多基本特征仍存在争议,例如 DNA 是否与所有或部分 EV 亚群相关?EV-DNA 是否位于内腔和/或 EV 表面?DNA含量和EV大小之间有什么关系?EV-DNA 是单链 DNA (ssDNA) 还是双链 DNA (dsDNA)?
对 EV-DNA 的研究通常通过从 EV 分离物中提取 DNA,然后进行丰度、片段长度和序列评估来进行。通过将 DNase 酶消化与 Fragment Analyzer 系统相结合,研究了 DNA 的相对丰度和定位(管腔内或与 EV 表面相关)。为了阐明 EV-DNA 在 EV 亚群之间的异质性,对分离的 EV 进行 DNA 分析通过密度梯度离心或不对称流场-流分馏已经进行。
尽管批量分析能够识别不同 EV 亚群中的 DNA,但结果可能存在争议,因为 EV-DNA 无法与无细胞 DNA 区分开来。由于 EV 的大小和货物含量差异很大,因此迫切需要单粒子技术来破译 EV-DNA 的巨大内在异质性,并将 EV-DNA 与游离 DNA 或其他污染物区分开来。然而,EV 的纳米级粒径(大多数大小<100 nm)和 EV-DNA 的低含量使其成为一个巨大的挑战。
细胞外囊泡 (Evs) 的分离和表征(图源自Journal of Extracellular Vesicles )
在过去的十年中,研究人员一直致力于开发一种高灵敏度的纳米流式细胞仪(nFCM)。它已实现对单个 EV、病毒、二氧化硅纳米粒子和金纳米粒子的光散射检测,分别小至 40、27、24 和 7 nm。对于荧光 (FL) 检测,检测到单个 R-藻红蛋白分子的信噪比为 17,有机染料的检测限确定为三个 Alexa Fluor 532 分子。
在本研究中,尝试通过将酶消化与 nFCM 相结合,在单囊泡水平上分析外部和内部 EV-DNA。研究了 DNA+ EV 的百分比以及 DNA 含量分布与 EV 大小、ssDNA 和 dsDNA 之间的区别、EV-DNA 和组蛋白的关联以及抗癌药物治疗后 DNA 含量的改变。
通过同时对单个颗粒进行侧向散射和荧光 (FL) 检测并结合酶处理,本研究表明:(1) 裸 DNA 或与非囊泡实体相关的 DNA 大量存在于由细胞培养物制备的 EV 样品中(超速离心培养基); (2) 单个 EVs 中 EV-DNA 的数量表现出很大的异质性,DNA 阳性 (DNA+) EVs 的数量在 30% 到 80% 之间变化,具体取决于细胞类型; (3) 外部 EV-DNA 主要定位在相对较小的 EVs 上(例如,HCT-15 细胞系 <100 nm),外部 DNA+ EVs 的分泌可以通过抑制外泌体分泌途径显著减少; (4) 内部 EV-DNA 主要封装在相对较大的 EV 的管腔内(例如 HCT-15 细胞系为 80-200 nm); (5) 双链 DNA (dsDNA) 是外部和内部 EV-DNA 的主要形式; (6) EVs 中未发现组蛋白 (H3),EV-DNA 与组蛋白不相关,(7) 基因毒性药物诱导 DNA+ EVs 的释放增加,外部DNA+ EVs和内部DNA+ EVs的数量以及单个EVs中的DNA含量均显着增加。这项研究为深入了解 DNA 与EV的关联提供了直接和确凿的实验证据。
论文链接:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
[来源:中国生物技术网]
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