他莫利嗪

#Hot Spots / 今日热点近日，南京中医药大学-江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室单进军教授和美国加州大学欧文分校杨勤教授在代谢性疾病领域权wei杂志Metabolism-Clinical and Experimental（JCR和中科院医学一区，IF: 13.934）合作发表了题为Reduced DMPC and PMPC in lung surfactant promote SARS-CoV-2 infection in obesity的研究性论文。肥胖是新guan病毒（SARS-CoV-2）高病毒载量的既定危险因素，会增加新guan肺炎感染者的住院率，患者的愈后情况也不容乐观，但是这一现象的潜在机制目前还未知。SARS-CoV-2主要侵袭肺部，它的刺突蛋白会与肺细胞上的ACE2受体结合。在进化过程中，肺发展出了专门的防御系统来预防感染，II型肺泡上皮细胞产生的表面活性物质是肺宿主防御系统的前线。肺表面活性物质是复杂的脂质和蛋白质混合物，脂质占比约90%，主要是磷脂酰胆碱（PCs）。而肥胖的特征是脂代谢异常，推测肺表面活性脂质的改变可能促进SARS-CoV-2感染，导致严重的新guan肺炎疾病。 但迄今为止有关肺表面活性脂质的研究报道较少（主要集中在表面活性蛋白），其原因可能是无法对复杂的脂质做出精zhun甄别。单进军教授团队利用Q Exactive高分辨质谱FullMS-ddMS2扫描模式可提供精确一、二级质谱信息这一优势，建立了肺表面活性脂质组学分析体系，并将之应用于肥胖小鼠肺组织和支气管肺泡灌洗液（BALF）的脂质分析，结果发现高脂饮食诱导的肥胖小鼠肺组织和BALF中的二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（DMPC）和1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（PMPC）的含量减少，而肺表面活性脂质中占比最多的二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）含量水平没有变化。在ACE2过表达的HEK293T细胞和内源性ACE2表达的Vero-E6细胞中研究PCs对SARS-CoV-2假病毒感染的影响，发现DMPC和PMPC均能显著抑制野生型和D614G突变株SARSCoV-2对HEK293T-ACE2和Vero-E6细胞的感染能力。但是，DMPC和PMPC并不能影响Spike-ACE2的相互作用。文献表明胆固醇在细胞膜中占脂质的30 mol%，在介导SARS-CoV-2进入靶细胞中起着重要作用，而PCs在哺乳动物细胞膜中也很丰富。通过细胞-细胞融合实验（以表达SARS-CoV-2 Spike/EGFP的HEK293T作效应细胞、以HEK293T-ACE2为靶细胞），探讨DMPC和PMPC可能的作用机制是通过替代细胞膜中的胆固醇来抑制SARS-CoV-2感染，并且DMPC和PMPC对SARS-CoV-2感染的抑制作用可以被胆固醇逆转。研究者还发现体外给予肥胖小鼠三肉豆蔻酸甘油酯，可增加其肺表面活性脂质DMPC和PMPC的水平。三肉豆蔻酸甘油酯组肥胖小鼠的肺泡灌洗液脂质提取物也可减轻野生型和D614G突变型SARS-CoV-2感染。综上所述，该研究应用肺表面活性脂质组学揭示了肥胖人群肺表面活性物质中DMPC和PMPC的含量变化和SARS-CoV-2感染能力的关系，并发现增加肺表面活性脂质DMPC和PMPC水平可能是防治肥胖患者感染新guan肺炎的一种创新策略，这为新guan肺炎的防治提供新的思路，具有重要的临床应用价值；在此研究基础上，研究者正从中药方剂中筛选可调控肺表面活性脂质的药效活性成分。单进军教授、杨勤教授为该文章的共同通讯作者，杜康博士和硕士生孙皊为共同第1作者。该研究获得美国国立卫生研究院R01基金和中国国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、江苏省“六大人才高峰”资助项目和江苏高校优势学科（中医学）建设工程资助项目的资助。近年来，单进军教授团队积极采用现代科学技术，解读中医药原理。2018年11月与Oliver Fiehn教授领导的美国加州大学戴维斯分校NIH西海岸代谢组学中心共建“医学代谢组学联合实验室”，建立了基于质谱的一liu代谢组学/脂质组学技术平台；同时依托江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，率xian利用“肺表面活性脂质组学”策略研究中医药防治病毒性肺炎和哮喘等呼吸疾病。相关成果发表在Metabolism、Pharmacol Res、Gut Microbes、Anal Chim Acta、Front Immunol、Phytomedicine等期刊。如需合作转载本文，请文末留言。

2013年10月10日，德国达姆施塔特 &mdash &mdash 德国默克集团生命科学相关事业部默克密理博今天对外宣布北京市高级法院判定支持一审法院判定上海瑞枫生物科技有限公司侵犯默克密理博专利，违法复制并销售实验室供水系统中纯化滤芯(Purification Cartridge)的判决。该法院判定上海瑞枫生物科技有限公司所被控告的产品属于默克密理博专利保护范围，并对上海瑞枫生物科技有限公司下达永久性禁令，要求其立即停止生产、销售和授权销售侵权产品。该判决同时支持一审判决中对默克密理博所蒙受损失的赔偿。　　&ldquo 我们对该判决结果非常满意&rdquo , 默克密理博实验室纯水业务全球副总裁伯南德.阿仁德(Bernard Arend)表示：&ldquo 这个是一个非常积极的信号,表明了中国政府和中国司法系统对知识产权重要性的肯定，对在中国从事业务的跨国公司和进行国际贸易的本土企业一视同仁。我们每年在研发中投入数千万美金，用以创造出比竞争对手更为创新、性能更加优越的产品。同时我们非常重视知识产权的保护，投入大量资金为集成在我们产品中的创新发明申请专利保护。我们将继续积极捍卫我们的专利。&rdquo 　　在法律允许的范围内，默克密理博将保留其向全球所有地区的任何继续销售本判决下认定的瑞枫侵权产品的经销商提起法律诉讼的权利。　　关于默克密理博　　默克密理博是德国默克集团生命科学相关事业部，提供各种创新高效的产品，服务及商业协作，让客户能够在生物科技和制药领域的研发和生产中取得事半功倍的效果。作为全球生命科学工具领域研发投入前三强的公司，默克密理博一直潜心吸收科学和工程领域新发现，作为战略合作伙伴协助客户推进生命科学进入新的篇章。　　默克密理博事业部总部位于美国马萨诸塞州比尔里卡(Billerica)市，在全球66个国家拥有大约1万名员工， 在2012年全年营收26亿欧元。在美国和加拿大，默克密理博以公司名 EMD Millipore运营。　　注：此新闻稿内凡提到默克或默克集团处均指总部位于德国达姆施塔特市(Darmstadt)的德国默克集团。

齐瑶研究难点病毒是一种个体微小、结构简单、只含一种核酸（DNA或RNA）、必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物。而病毒侵染宿主细胞却是一个非常复杂的过程，主要分为吸附（Attachment）、进入（Entry/Penetration）、复制（Replication）、大分子合成（Biosynthesis）、装配（Assembly）、释放（Release）等几个阶段，如图1。图1.HIV病毒侵染人源细胞过程示意图[1]如何从初始的吸附和进入阶段进行干预阻断，是病毒性疾病防治的切入点之一。以人类免疫缺陷病毒（HIV），也就是引发艾滋病的病原为例，它通过颗粒表面的包膜糖蛋白（Env）与免疫细胞表面的CD4分子、辅助受体互作，实现病毒与宿主细胞的融合、感染过程。科学家们曾运用BlaM（β-内酰胺酶分析：测量细胞群中病毒融合的技术）或细胞内病毒衣壳蛋白p24分析等多种方法对病毒的侵染过程进行检测，但由于技术的限制，均不能直接实时监测病毒进入宿主细胞的动态融合过程[2]。因此，在时间和空间上都具备高灵敏度的FLIM-FRET，成为了该项研究的破冰技术。FLIM-FRET经常关注徕卡课堂的同学们，想必对FLIM-FRET都不陌生了。在这里，我们再简单回顾一下几个关键性的概念。荧光寿命：荧光是指荧光分子吸收能量后，其处于基态（S0）的电子跃迁至激发态（S1），经过短暂停留，由激发态（S1）再回到基态（S0）时释放出光的现象，而荧光分子停留在激发态的时间就是荧光寿命（图2A）。与荧光光谱一样，荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质。FLIM（Fluorescence Lifetime Imaging，荧光寿命成像）：是一种基于荧光寿命的显微成像技术，其成像结果提供像素位点的寿命信息（如图2B），使得我们在荧光强度成像之外，能更加深入地对样品进行功能性测量。荧光寿命成像具有不同于荧光强度成像的众多优点，如不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响。但会因为分子构象、分子间相互作用、分子微环境、生理状态等条件改变而发生变化，因此荧光寿命可用于分析分子的这些变化，基于荧光寿命测量的FRET是FLIM的重要应用之一。图2. A. 荧光寿命示意图；B. FLIM：提供每个像素位点的荧光寿命信息（左）；基于荧光寿命信息的细胞成像结果（右）FRET（Fluorescence Resonance Energy Transfer，荧光共振能量转移）：供体荧光基团（Donor）的发射光谱与受体荧光基团（Acceptor）的吸收光谱有一定的重叠，当供体被激发后，且两个荧光基团间的距离小于10nm时，处于激发态的供体将把一部分或全部能量转移给受体，使受体被激发，即发生荧光能量的非放射性转移现象，为FRET（如图3），这一过程也伴随着供体荧光寿命的缩短和受体荧光寿命的延长。图3. FRET原理（左）[2]及FRET实例（右）（右）：用FLIM-FRET测量N1E-115 细胞膜上PH结构域的相互作用，发生FRET的细胞呈现较短的荧光寿命（偏绿），未发生FRET的细胞呈现较长的荧光寿命（偏红）FLIM-FRET兼具 FLIM 和 FRET 两者的优势，不受荧光物质浓度、光漂白、激发光强度等因素的影响，且样品制备简单，测量结果准确性高，易重复。因此，FLIM-FRET非常适合于进行分子间相互作用、分子构象或生理状态改变等的研究。应用实例那么科学家是如何将FLIM-FRET应用于监测HIV病毒侵入宿主细胞的动态过程呢，让我们看以下两个实例：（一）利用FRET生物传感器示踪HIV进入宿主细胞过程[3]来自牛津大学的研究者设计了一个HIV-Chameleon生物传感器，由一对能够发生FRET的荧光团（mTFP1和eYFP）组成，两个荧光团之间通过短肽序列（包含烟草蚀刻病毒TEV蛋白酶切割位点）链接在一起（如图4A右）。TEV蛋白酶（TEVp）可以与HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合，掺入病毒颗粒中。当包含TEV蛋白酶的病毒与表达生物传感器的细胞融合时，Vpr-TEV或Gag-TEV（rTEV）被释放到细胞质中，并特异性地裂解链接序列，增加mTFP1与eYFP之间距离至10nm以上，阻断FRET，并可通过FLIM进行测量。图4B为FLIM伪彩图与图像中所有像素的寿命直方图，其中蓝色表示较短的寿命（无融合），红色表示较长的寿命（融合）。这样就可以实时定量荧光寿命的改变，从而示踪病毒与宿主细胞融合的瞬间动态过程。作者将所得结果与广泛使用的BlaM分析结果比对，二者具有高度匹配性，因此，HIV-Chameleon生物传感器与FRET-FLIM的结合使用，可以实现单个活细胞或群体的病毒融合动力学实时监测。图4. HIV-Chameleon检测病毒融合[3]A.（左）TEV蛋白酶（TEVp）与HIV-1 Vpr蛋白或Gag蛋白融合的两种包装过程；（右）HIV-Chameleon生物传感器示意图；B.病毒融合前后的荧光寿命成像（Scale Bar=30μm） （二）细胞代谢水平对于HIV-1侵染宿主细胞的影响[4]研究人员在HIV-1病毒的侵染机制研究中发现，病毒侵染过程中，宿主细胞代谢水平与膜状态改变有关。将FRET生物传感器瞬时转染到细胞中（如图5A），记录瞬时表达这些生物传感器的细胞的FLIM图像，并进行BlaM分析，结果表明，乳酸浓度较高的单细胞与病毒融合性更高，此外，具有更高ATP/ADP比率的细胞与病毒的融合性更高（如图5B）。也就是说，糖酵解通量较高的细胞更容易被HIV-1感染。 图5. 单个细胞中的相对乳酸浓度和ATP / ADP比率与HIV-1融合相关[4]；（A）FRET生物传感器 （B）同样区域细胞的BlaM（上）和FLIM成像（下），白色实线所示为正在与病毒融合的细胞，在BlaM中呈红色，荧光寿命较长，白色虚线所示为未融合的细胞，BlaM中呈绿色，荧光寿命较短进一步的分析表明，2-脱氧-d-葡萄糖（2-DG）对糖酵解的靶向抑制作用大大降低了HIV-1的融合和感染。而用2-DG处理的细胞分别具有较低的膜胆固醇和较高的膜张力值。因此，作者构建了一种基于Ypet/eCFP FRET的膜张力感应器MSS，由一个弹性张力传感模块和两个与脂分子连接的蛋白质组成，这两个蛋白质锚定在质膜的Raft和非Raft区域，对膜张力变化非常敏感（如图6）。通过FLIM测量单个细胞MSS张力探针瞬时表达，证实了HIV-1需要在膜张力较低的区域进入细胞，也进一步确定了宿主细胞糖酵解活性和膜张力之间的联系，其在活细胞中的单病毒融合水平上实时影响HIV-1融合。图6.（左）灵敏型膜张力感应器MSS探针以及对照组非灵敏型感应器KMSS探针示意图；（右）多种不同处理条件下，TZM-bl 细胞表达MSS的FRET效率成像[4]总结FLIM-FRET提供了基于群体方法或光谱方法所难以实现的单细胞微环境中的分辨率，能以高时空分辨率在单个细胞中可视化和识别影响HIV-1感染的关键因素，实现单一病毒跟踪技术。这对于在HIV-1感染早期阶段寻找艾滋病的治疗方法，有着重要的科学意义。创新、高效的技术和设备，是科研工作者们揭示生命奥义的得力工具，也是在面对新型突发病毒时的尖兵利器。Leica全新 STELLARIS 8 FALCON荧光寿命成像系统，搭载新一代白激光（440-790nm）以及HyD X高灵敏度专用检测器，提供超快速、多维度荧光寿命成像解决方案。想了解更多关于Leica STELLARIS 8 FALCON产品信息或病毒的研究方法，敬请关注徕卡的微信公众号“徕卡显微系统”，我们下期再见。 [1] https://ricochetscience.com/viruses-human-genome/[2] Molecular Sensors and Nanodevices (Second Edition). Chapter 5 - Optical transducers: Optical molecular sensing and spectroscopy(2019)[3] Imaging real-time HIV-1 virion fusion with FRET-based biosensors. Jones DM, Padilla-Parra S. Sci Rep. 2015 Aug 24 5:13449.[4] Single-cell glycolytic activity regulates membrane tension and HIV-1 fusion. Coomer CA, Carlon-Andres I, Iliopoulou M, Dustin ML, Compeer EB, Compton AA, Padilla-Parra S. PLoS Pathog. 2020 Feb 21 16(2):e1008359.