实验条件

实验材料和方法

293T 细胞裂解液酶切肽段，样品中加入 iRT 肽段用于保留时间校正，DDA 和 DIA 数据采集，每种采集模式平行进行三次技术重复，DDA 用于构建谱图库，DIA 用于定量分析。

相同的 293T 样品用于 170 min 色谱梯度的 DIA 数据采集，并且平行进行 3 次技术重复，考察 DIA 的定量能力和CV。图 1 是 3 次 DIA 实验的 Base peak 图，保留时间和响应均一致，显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定性是获得可信非标记定量结果的前提。

3 次 DIA 实验分别能够抽提到 77,695 个肽段，6,028 个蛋白；77,673 个肽段，6,042 个蛋白；77,556 个肽段， 6,019 个蛋白（表 1）。DIA 能够鉴定到谱图库中 88% 的肽段，96.7% 的蛋白，显示 DIA 具有较高的分析通量。三次 DIA 实验肽段的 median CV 7.5%，蛋白的 median CV 4.3%，显示出 DIA 具有非常好的重现性以及定量的准确性。DIA 提峰的质量精度在经过校正后能够达到 3 ppm， 显示 Orbitrap 具有较高的质量精度。DIA 数据处理的方法就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提，Orbitrap 能将质量抽提窗口缩小到 3 ppm，那么基于 Oribtrap 的 DIA 就能获得较好的选择性（图 2）。

TPA（Total Protein Amount）方法可以进行每个蛋白丰度的估计（5）， 假设总的上样量是 1 µg。通过计算，丰度最高的蛋白是 Histone H2B type 1-L，柱上绝对浓度是 4631 pmol。丰度最低的蛋白是 Sister Chromatid cohesion protein DCC1，柱上绝对浓度是 6 fmol。丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级，显示 Orbitrap 具有非常宽的动态范围。

实验结果

1. DDA 鉴定结果以及谱图库建立

取 293T 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱梯度的 DDA 数据采集，为了获得较全面的谱图库，DDA 实验平行进行三次技术重复。3 组 DDA 数据用 Proteome Discoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide FDR<0.01， protein FDR < 0.01，一共鉴定到 90,202 个肽段，6496 个蛋白，平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段，显示 Q Exactive HF 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。

将 Proteme Discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入Spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于Spectronaut DIA 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽段至少包含 3 个碎片离子，最多包含 6 个碎片离子，碎片离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎片离子，87,743 个肽段，6,270 个蛋白。