细胞裂解液的制备与裂解方法介绍

细胞裂解液的制备

一、试剂准备
1、新鲜配制冷的RIPA裂解缓冲液:
150mMNaCL
1%NP-40(去垢剂)
0.1%SDS(去垢剂)
2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)
2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制剂)(使用前加入)
1mMPMSF(蛋白酶抑制剂)
1.5mMEDTA(蛋白酶抑制剂)
1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制剂)(任选)
以上所有试剂均按比例溶于150mMNaCL溶液中。
2、冷的PBS中加入1mMPMSF
1.5mMEDTA
1mMNaVanadate（钒酸钠）(任选)
3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。

二、实验步骤
1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。
2、向培养瓶中加入冷的RIPA裂解缓冲液(每75cm2培养瓶加1ml).然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。
3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。
4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。
5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用BioradBradford试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在-70℃。

细胞裂解一般用物理或者化学方法

物理法：
（1）反复冻融：将细胞反复放置于-20℃冷冻以及25-30℃环境下，反复冷冻溶解10次-20次。适用于例如血细胞等大部分哺乳动物细胞。
（2）煮沸法：与冻融法相反，将细胞放置于100℃沸水煮沸5-10分钟，适用于大部分微生物细胞。
（3）超声法：将细胞放置于超声破碎仪中，以一定频率的超声破碎细胞，适用于绝大部分微生物细胞。
（4）渗透压法：将血细胞等细胞膜较为薄弱的细胞放置于纯水等低渗溶液，细胞吸收大量水分破解。
（5）液氮法：植物细胞一般采用液氮捻磨的方法破解细胞。

化学法:
（1）强酸、强碱溶液：一般应用0.5NNaOH溶液可以裂解绝大部分动物细胞和微生物细胞。
（2）生物酶：一般用溶菌酶、蛋白酶K等酶裂解微生物细胞。