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获取电话构巢曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒
【产品名称】
英文名称：Aspergillus nidulans PCR Kit
中文名称：构巢曲霉探针法荧光定量PCR试剂盒
【包装规格】
50T/盒
【预期用途】
构巢曲霉(Aspergillus nidulans.)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属的一种真菌，分布于粮食、土壤和空气中。曾用作真菌遗传学研究材料。作为质控菌种，可用于水质检测，化妆品检测，食品与药品检测，为大中型科研提供严格质量体系控制的 ATCC,CMCC,CICC,DSMZ 标准菌株。因此快速检测构巢曲霉具有重要意义。本产品就是以探针法荧光定量 PCR 技术为基础开发的专门检测构巢曲霉的试剂盒，它具有下列特点：
1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。
2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。
3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4. 特异性高，引物是根据构巢曲霉高度保守区设计，不会跟其他微生物的 DNA
发生交叉反应。
5. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。
6. 本产品只能用于科研。
【检验原理】
本试剂盒采用 TaqMan 探针法实时荧光 PCR 技术，针对构巢曲霉的基因高度保守区域设计特异性引物，用荧光 PCR 技术对构巢曲霉的核酸进行体外扩增检测，在反应体系中含构巢曲霉核酸模板的情况下，PCR 反应得以进行并释放荧光信号，利用仪器对 PCR 过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性、定量分析。
【试剂组成】
名称 | 规格 |
构巢曲霉扩增液 | 25μL×1管 |
构巢曲霉反应液 | 975μL×1管 |
构巢曲霉阳性质控品 | 50μL×1管 |
构巢曲霉阴性质控品 | 50μL×1管 |
说明书 | 1份 |
备注：1）不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融少于 7 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】
ABI 、MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
自备：无 DNA/RNA酶的 1.5mL 离心管，0.2mLPCR反应管，滤芯吸头(规格:10μL，200μL，1000μL)，离心机，振荡混合器，各种规格的移液器。
【样品要求】
1. 根据实际情况，病死或扑杀的牛，无菌剪取肠道等样品，活畜取全血、血清血浆、粪便、呕吐物、口腔鼻咽呼吸道分泌物、咽喉部鼻孔眼部和肛门拭子和病毒培养物作为检测样本。
2. 应避免样本间交叉污染，样本采集后应及时检测，也可保存于-20±5℃待检，长期保存应置于-70℃以下。
【样品保存和运输】
上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃，但不能超过 6 个月，标本运送应采用 2~8℃冰袋运输，严禁反复冻融。
【使用方法】
1. 样品处理（样本处理区）
1.1 样本前处理
按照试剂盒操作说明或者微生物样品处理方法做好样品前处理。
1.2 DNA 提取
根据您实验室的具体情况和样品类型，选择适当的提取策略方法。为了使实验结果稳定、有效、可靠，我们建议使用商品化的试剂盒进行提取，严格按照对应试剂盒说明书进行操作，样本核酸提取过程中应避免污染，提取好的模板样品如不能立即检测，建议-15℃以下保存。
推荐采用我们公司研发生产的试剂盒：Hypure 病毒基因组 DNA 提取试剂盒
2. 试剂配制（试剂准备区）
2.1 从-15℃以下冰箱中取出试剂盒平衡到室温（20～25℃），注意避免强光照射，待完全溶解后振荡混匀并低速离心 10 s，使用低吸附吸头分液取样，避免试剂损失和浪费。
2.2 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N(N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；样品每满 7 份，多配制 1 份)，每测试反应体系配制如下表：
试剂 | 构巢曲霉反应液 | 构巢曲霉扩增液 |
用量（样本数为N） | 19.5μL | 0.5μL |
2.3 在适当容积的无菌离心管中加入上述试剂，充分振荡混匀后 2000 rpm 离心 10 s，按照 20 μL/管分装量将试剂分装至八联 PCR 反应管中。
2.4 盖紧八联 PCR 反应管盖, 并注意做好相应标识（请标记在八联 PCR 反应管盖两端突出部位，切勿标记在八联 PCR 反应管盖中间，以免影响信号采集）。将 PCR 反应管转移至样本准备区，剩余试剂放回-15℃以下冰箱冷冻保存。
3. 加样（样本处理区）
将步骤 1.2 提取的 DNA、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心，核酸加样过程中应避免污染。
4. PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1 将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内, 并记录放置顺序。
4.2 设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25 μL；
荧光通道选择：检测通道选择 FAM， 淬灭通道选择 NONE，参比荧光选 NONE。
4.4 推荐循环参数设置：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | 收集荧光信号 |
1 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
2 | 40 cycle | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 否 |
5. 结果分析判定
5.1 结果分析条件设定
设置 Baseline 和 Threshold：一般直接按机器自动分析的结果分析，当曲线出现整体倾斜时，根据分析后图像调节 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范围内调节)、stop 值(一般可在 5~20 范围内调节)，以及 Threshold 的 Value 值(上下拖动阈值线至高于阴性对照)，重新分析结果。
5.2 结果判断
阳性：检测通道 Ct 值≤35.0，且曲线有明显的指数增长曲线。
可疑：检测通道 Ct 值>35.0，且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验，重复试验结果出现 Ct 值≤38.0 和典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。
阴性：检测结果 Ct 值无 Ct 值，无明显的扩增曲线。
6. 质控标准
阴性质控品：无明显扩增曲线或无 Ct 值显示；
阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤30；
以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
7. 产品性能指标
阴阳性参考品符合率：5 份阳性参考品符合率为 100％；10 份阴性参考品符合率为 100％。
最低检测限：1.0×103copies/mL。
精密度：批内、批间精密度检测 Ct 值的变异系数（CV）均小于等于 3%。
8. 检测方法的局限性
样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
9. 注意事项
所有操作严格按照说明书进行；
试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
反应液应避光保存；
反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。
特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！
