多肽药物是介于大分子蛋白/抗体类药物和小分子药物之间的一 类重要的药物分子,因其生物活性高、靶向专一性高、选择性 高、毒副作用低等优点而被广泛应用于疾病治疗领域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率,质量轴稳定性,已经广泛应用 在了多肽药物结构表征中。Obitrap 作为高分辩还具有极高灵敏 度和线性范围,因此也被越来越多的应用到药物的定量研究中。
PTH 是甲状旁腺主细胞分泌的由84个氨基酸组成的多肽类 激素,其对于维持钙磷代谢的稳定起着至关重要的作用。 特立帕肽(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF,4117.7 Da)是一种人工重组合成的人PTH 1-34多 肽,是第一个被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的抗骨质疏松性骨折的骨合成药物。 Thermo Scientifific Q Exactive Focus 四极杆 Orbitrap 组合型质 谱仪专为常规分析应用而设计,最高分辨率为7万,最大分辨 率12Hz,可以在同一系统中同时实现准确可靠的定性和定量分析。
Obitrap Fusion Lumos是赛默飞世尔科技在2015年推出的三合 一的静电场轨道阱超高分辨质谱仪。Lumos搭载的分段式四级 杆技术(Advanced Quadrupole Technology,AQT)使离子传 输效率至少提高了 2 倍,超高场的Obitrap拥有50万分辨率和 20Hz的超快扫描速度,使Lumos在具有极佳的灵敏度同时,还 拥有稳定性和动态范围。
本实验将基于两款Obitrap高分辩质谱Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽药物特立帕肽的定量分析方法,考 察高分辩质谱Obitrap的定量能力。
实验结果
1、特立帕肽标准品在Focus,Lumos上的线性与准确度。
用稀释剂(含0.1ug/μL BSA,1% FA,5% ACN)的稀释剂逐级 稀释特立帕肽标准品,配置成一系列浓度标准品,上样分析。 结果表明,Focus对特立帕肽的定量下限为50 pg/mL, 上样5μL,上柱约60 amol,标准曲线线性良好,R2=0.997,标 准曲线各点回算的浓度在理论值的15%以内。
特立帕肽的LOQ点在Focus和Lumos上的提峰图如图,峰型良 好,信噪比S/N>10,重复5针的RSD<10%,表现出了 良好的稳定性。
图 Focus,Lumos上LOQ的峰图
2、特立帕肽血浆样品在Lumos上的线性与准确度。
同时在Lumos上考察了特例帕肽血浆样品的定量下限。取150 μL的空白人血浆,加入一系列浓度梯度的特立帕肽标准品,配 置成血浆标曲,用1:6体积的75% 乙腈沉淀后,离心去上清, 挥干,复溶后进样。 结果显示,Lumos对于基质复杂的血浆样品仍表现出良好的线 性,精密度,稳定性。特立帕肽最低定量下限为50 pg/mL,线 性范围50 pg/mL-50 ng/mL,1000倍的线性范围,上柱 量约60 amol,标曲各点Diff值 < 10%。
结论 本文分别在Obitrap Focus,Lumos上建立了大分子多肽类药物 特例帕肽的定量分析方法。结果表明,高分辩Obitrap对特立 帕肽表现出良好的定量能力,定量下限可以分别达到上柱60 amol,24 amol。同时,对于基质更为复杂的血浆样品,Lumos 上可以达到定量下限上柱60 amol,灵敏度满足临床上对特立帕 肽的检测要求。Obitrap作为高分辨质谱,在拥有超高分辨率的 同时,兼具出色的灵敏度和稳定性,可以应用大分子多肽类药 物的定量分析与检测。
[来源:赛默飞]
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