一文了解|为什么癌症早期诊断离不开单EV分析？

EVs的优势首先在于其含量丰富，肿瘤细胞在生长过程中可持续不断地分泌EVs并进入循环系统，且因其代谢速率高导致EV的产量也远高于正常细胞。此外，相比于ctDNA的生成依赖于肿瘤细胞的死亡，EVs由活细胞所产生，它的产生更像是一个持续发生的事件，可以实时反映肿瘤发展的进程。例如，在晚期黑色素瘤中，含有突变等位基因BRAFV600E和cKITD816V的DNA更多与EVs之间并无相关性，但并不能据此判断为早期黑色素瘤；而另一项研究发现了exoDNA和ctDNA之间具有很好的相关性，但exoDNA的KRAS突变的存在与新辅助治疗后的疾病进展紧密相关。此外，EVs的磷脂双层膜结构可有效保护其所运载的RNA和蛋白质，避免其在循环系统中的降解，使得RNA和蛋白可被用于肿瘤的“液体活检”。

图1. 液体活检在癌症分析中的作用

现有的文献模型通常认为外泌体以及其它EVs包含有大量的蛋白质和核酸。这些观点大多数基于不考虑异质性的前提下，对一群EVs选用的集权平均的分析方法获得的结果。随着EV研究的深入，科学家发现单个EVs上的蛋白质和核酸远没有那么丰富，只有很小一部分EVs含有肿瘤特异的标志物，如突变的蛋白质等（图2）。那如何在循环系统这一EVs的汪洋中检测出这部分高度特异但是稀有的ctEVs？此外，高度的异质性是EVs的主要特征之一，即使来源于同一个细胞的EVs之间也是千差万别，且肿瘤群体中的细胞本就具有极大的多样性。基于以上因素，EVs的单颗粒水平分析就成为了基于EVs的“液体活检”的必经之路。

图2. EV的组成

单个EV分析技术的优势之一就是能够揭示EVs的异质性，并将EV蛋白、核酸组成与亲代细胞的组成进行比较。在单个EVs水平，蛋白标志物的含量比mRNA以及DNA生物标志物的含量高很多，且这些肿瘤相关标志蛋白可被抗体简单有效识别。最近，来自麻省总院的Weissleder教授团队发现即使几乎所有的ASPC1细胞（人转移胰腺癌细胞系）均表现为KRAS^mut，P53^mut或者其他生物标志物（MUC1，EGFR或FG-P4OH等）阳性，但其所产生的EVs也仅有40%表现出KRAS^G12D阳性或P53^mut阳性。类似的现象在其它胰腺癌细胞系中也均有发现，即从细胞上清中收获的EVs中大约40-50%没有相关肿瘤标志物的表达。

人血液中的ctEV被其他细胞衍生的EVs进一步稀释了，那血液中ctEV的丰度和异质性如何呢？有模型计算得出，人体内的肿瘤每增大1 mm³，每毫升血液中相应地会增加23-1900个ctEVs。即使是分泌速度最慢的肿瘤细胞，其所释放EVs的速度也比非肿瘤细胞高至少一个数量级。这个结果与很多文献报道的发现吻合，在晚期肿瘤患者体内，均发现循环囊泡的数量成倍增加。因此，一种灵敏的检测方法，如果能在1 mL血液中检测出小于1 mm³的肿瘤，将有望把癌症早期检测和监控提前几年甚至十几年。可惜目前绝大多数的分析技术远远达不到这么高的灵敏度。由于非特异性的背景信号占据主导和并非所有的ctEVs的癌症特异标志物都是阳性的这两大原因，传统的集权平均的方法，如WB和ELISA等，能够测到小于1 cm³的肿瘤的概率微乎其微。而新型单囊泡分析技术在这一领域则被寄予厚望。

针对EVs的集权平均分析方法的相关综述屡见不鲜，而利用EVs真正实现癌症早期诊断的报导则屈指可数。近5年才开始陆续出现能够实现单个EV的表型分析的方法，其中大多数方法利用荧光传感，光散射或者电子吸收等原理。典型的研究型方法包括透射电镜，冷冻电镜，原子力显微镜，超分辨荧光显微镜，全内反射荧光显微镜，拉曼光谱等，而这些方法往往伴随着需要比较多的操作时间、贵重的仪器设备以及专业的操作技能，通量低等局限性。

经过多年的持续发展，在临床环境中实现单EV分析并且具有诊断前景的技术已经出现，主要围绕分离或者传感等需求。这些方法在准确度、复杂程度、诊断时长以及每个样品的花费方面均有差异。其中，无偏见单EV分析已经成功应用于几种癌症类型的诊断，包括结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、宫颈癌、黑色素瘤以及胰腺导管腺癌（PDAC）等。

早在2018年，就有学者利用纳米流式检测技术在单EV水平实现了结直肠癌的早期诊断。今年厦门大学的科研团队基于EVs发展了鼻咽癌的早期诊断方法，AUC可达1.000，该方法同时可实现鼻咽癌和鼻咽炎的区分。(厦大团队揭秘如何通过EVs区分癌症和炎症)

目前基于EV的发现研究绝大多数基于集权平均的分析方法，且鲜有验证研究的报道。一种方法能否进入临床，有一些先决条件：

单EV分析中的大多数技术挑战已经被攻克，但仍然存在一些重要挑战。这其中包括需要更深层次的分析手段来：

缺乏严格、控制良好的临床研究是其中一个尤为重大的挑战。

早期诊断对于肿瘤的干预和治疗的重要性是毋庸置疑的。单个EV的分析将探索和阐明循环EVs带入到一个令人兴奋的新研究领域，希望其作为新兴的临床分析方法可以用于各种不同恶性肿瘤的早期筛查。