我国学者开发出高效微型CRISPR-SpaCas12f1基因编辑系统

上海科技大学季泉江教授团队在Cell Reports发表了题为 “Guide RNA engineering enables efficient CRISPR editing with a miniature Syntrophomonas palmitatica Cas12f1 nuclease”的研究论文。

该论文报道了Syntrophomonas palmitatica Cas12f1（SpaCas12f1）的生化特征及DNA切割机制，证明CRISPR-SpaCas12f1系统能在细菌中实现多种编辑目的，且通过工程化向导RNA使该系统转化为哺乳动物细胞中高效的基因组编辑器。

CRISPR-Cas系统是目前常用的基因编辑工具，但是由于传统的Cas核酸酶分子量普遍太大，使其在在体基因治疗的应用中受限。近年来，为了解决这一难题，小的Cas核酸酶逐渐被发现和探究。其中，Cas12f 核酸酶是目前紧凑的 CRISPR 效应核酸酶，比传统Cas9和Cas12a核酸酶小一半以上，在临床治疗应用中具有巨大潜力，然而高效的Cas12f基因编辑系统仍旧较少。

图1.CRISPR-SpaCas12f1的表征与改造

来自Syntrophomonas palmitatica的紧凑型SpaCas12f1只有497个氨基酸，该研究首先系统地表征了SpaCas12f1的生化特性及对DNA识别与切割的模式，证明了SpaCas12f1是一种镁离子依赖的嗜热核酸酶，可在tracrRNA和crRNA的帮助下有效切割含有5' -NTTY (Y代表C或T)PAM的双链DNA。此外，SpaCas12f1拥有与AsCas12f1相似的切割模式，即在靶向链上引入一个切口，非靶向链上引入两个切口（图1）。

由于SpaCas12f1在大肠杆菌中拥有质粒干扰活性，为探究其能否成为一个在细菌中高效的基因组编辑工具，研究人员通过引入SpaCas12f1和Lambda Red重组酶系统及单链修复模板，实现了CRISPR-SpaCas12f1在大肠杆菌（Escherichia coli）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）中多种精准的基因组编辑。同时，研究人员发现SpaCas12f1的tracrRNA具有独特的head-to-toe的发夹结构，这是限制SpaCas12f1在哺乳动物细胞有效编辑的主要因素。通过对RNA二级结构预测及小RNA测序结果分析，研究人员设计了五种策略，系统地工程化向导RNA，成功地获得了高效的引导RNA，gRNA_MS13，从而实现CRISPR-SpaCas12f1高效哺乳动物细胞编辑。

这项研究扩展了微型CRISPR核酸酶工具库，并为基因治疗和工程化微型CRISPR系统提供了新的思路。