Azure Cielo™ Real-Time PCR的光学系统无需ROX校准

ROX是一种广泛使用的惰性荧光染料，通常添加到qPCR反应液中以校正荧光信号。然而，随着荧光技术在仪器中的发展，比如在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，为了标准化而单独使用染料的步骤已不再需要。当实时荧光定量PCR系统首次引入市场时，许多产品使用固定光源和检测系统对96孔整板进行同时成像，导致热块中每个孔的光路不同（图1）。光程差异将导致每个孔的绝对荧光测量值发生变化，这取决于它们在板上的位置。例如，具有较短光程的孔可能比具有较长光程的孔具有更高的荧光读数，从而导致两孔之间的荧光值偏差增大。因此，许多研究者开始使用参考染料（如ROX）对这种信号变化进行标准化校正。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR的光学系统

由图1可知，在传统实时PCR系统的全板成像中，与角落的孔相比，中心区域的孔可以检测到更高的荧光信号。由于ROX信号不受qPCR反应的影响，只要qPCR混合液的属性保持不变，那么它在整个qPCR过程中也会保持稳定。基于这个原因以及ROX更优越的光谱特性，ROX被视为一个很好的参考染料，可用于荧光信号的归一化处理，以校准光程差引起的荧光变化。但是ROX作为参考染料的挑战在于，它占用了一个可能用于检测靶标的荧光通道。随着流感病毒和COVID-19新冠病毒（参照ANDiS SARS-CoV-2 and Influenza A/B RT-qPCR Detection Kit）等应用变得越来越普遍，多重反应也越来越常规，这也说明了多通道检测的重要性。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统采用新型的高性能光学系统，在qPCR实验中无需ROX校准。该光学系统采用16组光纤单孔扫描设计，一根光纤用于高能LED激发，另一根用于光信号检测，可16孔同时采集，确保数据采集的一致性（图2）。此外采用“全孔检测”技术，每个孔可采集大约100,000个数据点，检测时取读数的平均值，精准测定每个孔的荧光强度（图3）。这种“全孔检测”为每个采集时间点提供了比单孔扫描系统更具重现性和可靠性的数据，因为单孔扫描系统仅仅采集少量的数据点。

应用实例：

1、方法：

配制20µl反应体系，在Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统进行10个重复孔的qPCR扩增。

2、结果与讨论：

结果表明，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统能很好地检测到每个qPCR扩增产物。由图4可知，10个重复孔的扩增曲线高度一致，说明所有孔检测到的信号均匀增加；计算得出Cq平均值为17.54，标准偏差低至0.02。Cq值的变异系数（CV）为0.13%，也反映了数据的高精准度。

光纤检测系统与Marlow-Peltier温度模块相结合，在qPCR实验中实现了孔间信号检测的均匀性和加热温度的均匀性，并且由于每个样品都是单孔激发和扫描，因此避免了背景信号的干扰。通过10个重复反应的低标准偏差和CV值进一步证明了Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统的产品特点，即可完全消除光程差，不需要使用ROX进行均一化处理，Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统仍能获得高精准度的可靠数据。

Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统

Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统来自于美国Azure Biosystems公司，可为您提供3/6检测通道，根据实验需求灵活配置。这款产品采用了高能LED作为光源系统，可保证光源强度高，光源一致性好；高品质的帕尔贴温度模块作为温控系统，升降温速率快，可设置12列跨度30°C的温度梯度；卓越的CMOS拍照+光纤信号传输作为检测系统，CMOS检测灵敏度高，光纤传输速度快，无光损失和噪音干扰，无需ROX校准。Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统可为您的科学研究提供高精准度、高灵敏度和高可靠性的实验结果。

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