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“药”点笔记 | 浅析新冠病毒疫苗研发技术路线及工艺解决方案 (上)

仪器信息网 2020/05/14 15:25:18 点击 2881 次
[导读] 全球新冠疫情愈演愈烈的背景下,疫苗被寄予彻底终结疫情的厚望。那么我们要如何优化研发流程才让全球不同背景的研发者都可以跑步前进研发新冠疫苗呢?

全球新冠疫情愈演愈烈的背景下,疫苗被寄予彻底终结疫情的厚望。然而,世界卫生组织不止一次强调疫苗的开发很难在18个月内完成。要知道,最近几年人类的疫苗研发往往耗时数年。但这一次,人类必须提速。那么我们要如何优化研发流程才让全球不同背景的研发者都可以跑步前进研发新冠疫苗呢?

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全球新冠疫苗开发现状

根据WHO官网提供的的全球疫苗临床实验项目清单,截止到4月20日,一共有下列项目位居前列:

WHO官网提供的的全球疫苗临床实验项目清单.jpg

WHO:全球新冠疫苗试验候选清单

其中,核酸疫苗属于新型疫苗,早期研发速度快,但风险在于并没有已经的上市品种作为验证;腺病毒载体疫苗由于有埃博拉研发先例,因此研发进度相对较快;灭活疫苗技术最传统,但同时综合风险也最低。

疫苗虽然是药品,但它比较特殊。与其他药品相比,它是给健康人群,甚至是给婴幼儿、老年人等特殊人群使用的。

所以对于疫苗,人们的主要关注点在于:

1)疫苗是否有效?

2)疫苗是否安全?

3)疫苗是否经济?

——疫苗研发不是投入500万做出一支疫苗只给一个人使用,而是研发出一支几十元、几百元的疫苗给几百万人使用。

疫苗研发必须要平衡这三点:安全性、有效性、经济性。

 

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新冠病毒疫苗的开发策略浅析

 

新冠病毒是一种新型的冠状病毒,跟SARS和MERS病毒属于同一属。这个病毒大小是125纳米,结构上相对比较大。比流感病毒,略大,(流感病毒80-120纳米)。针对本次新冠病毒疫苗的开发,各个国家的研究团队策略不同。其中有的传统,有的新锐。不同的疫苗研发路线,各有优缺点。

一种是基于传统病毒疫苗的开发思路——也就是用病毒培养的方式。然而,即使都是病毒培养的方式,也不尽相同,有的方式是用细胞工厂或微载体;有的则在灭活脊髓灰质炎的平台操作;有的是基于流感疫苗基培的基础做的。

重组蛋白的疫苗研发这条线,也有用不同的表达系统。比如大肠杆菌酵母的,目前听起来比较少,但做CHO表达的相对比较多,另外是做昆虫系统表达的。此外是病毒载体疫苗。另外还有比较新的mRNA的疫苗,DNA疫苗。一种是化学合成,另一种是大肠杆菌表达质粒。在这些过程中,灭活的方式被普遍采用。

对某些公司来说,他们可能自己有成熟的病毒平台或是曾经拿到过SARS疫苗批件,所以平台相对比较成熟。另一些些公司则在用灭活脊髓灰质炎的平台。脊髓灰质炎的平台对生物安全的要求比流感病毒更高,它是用发酵罐的微载体培养,过程中的密闭性是关键点。

新冠疫苗是一个新的病毒,因此在任何情况下,不论是病毒发酵液,浓缩液,只要是灭活前,具有活性的,都应该封闭在一个密闭容器中,不与操作人员接触以保证安全。因此,使用一次性的生产方式,一次性的发酵袋和氮液焊接的方式无菌连接,可以避免了人和液体的接触

此外,病毒载体的进展非常快。病毒载体的平台上,有的公司已经有比较成熟的病毒载体工艺,可以把上游病毒柱重新构建、筛选并筛选出更高产的毒株以提高病毒产量。

当然,前期筛选的过程中,应当选择更高效的微型全自动生物反应器。一是提高研发速度,二是出于安全性的考虑——不需要对罐子清洗、灭菌、消毒的过程,而且体积能在ambr的系统里,15ml或是250ml的体积下,对前期的筛选工艺非常重要。后续平台的工艺,就类似一个病毒疫苗生产的过程,这也是我们在腺病毒载体工艺的一个过程。这个过程里,病毒载体疫苗之所以进展很快,也是因为使用了一次性生物反应器后可以在大规模培养的情况下提高生产速度。

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赛多利斯在不同类型的下游工艺步骤中

有哪些解决方案

前文提及,疫苗的研发生产,必须要平衡这三个点:安全性、有效性、经济性。

在平衡过程中会面对很多的挑战。例如:工艺是不是能得到很好的优化?足够有韧性,能用工艺制作出安全、有效的疫苗,有没有质量控制的风险策略?使用什么密闭系统?如何使用可以减少生产过程中的交叉污染?下面我们就为大家具体介绍一下。


病毒的检测

传统病毒检测,做病毒类产品的朋友应该比较熟悉,主要分为两类:一类是基于功能性的检测,主要有TCIB50,另一类是基于非功能性的检测,例如检测核酸,QPCR,检测所有的病毒的核酸,还有检测总蛋白,像ELISA和HPLC,还有像电镜,是检测病毒颗粒的。Virus Counter技术,是对病毒的完整颗粒进行检测,原理是基于荧光染色技术,流式技术实现的。它的染色剂可以对病毒的核酸和包膜上的蛋白进行染色,两个信号同时出现的时候就会被记为一个病毒。使用的过程很简单,经过30分钟染色——染色过程多样品同时进行,每个样品单独检测只需要2~5分钟即可,是一个极快的病毒检测方法。

这种检测可以带来对样品里的病毒的状态更准确的认识:例如可以知道有多少是空壳的,有多少是有活性的,有多少是空壳但是没有活性的状态。尤其对疫苗来说,这是个非常有价值的数值。因为所有产生免疫活性的成分并不全是有活力的,像空壳的,也可能发生免疫反应,如果仅仅以活性判断,就有可能导致注射到人体内的免疫源过量造成患者的安全风险。

Virus Counter有两种检测试剂。一种是Combodye,通用型,可以对所有有囊膜的病毒进行染色。目前我们已经有20多种病毒成功应用。包括冠状病毒、慢病毒、流感、埃博拉、痘病毒、狂犬等等。目前的新冠病毒,也属于冠状病毒类,有囊膜的病毒,可以用Combodye染色技术。另外一种是ViroTag,是基于抗体特异性染色的,只能检测有相应抗体染料的病毒,例如现在开发出来的AV二、AV三、杆状病毒,还有流感病毒,有A型,B型,等等。

除菌滤器的使用和选择

随着过滤技术的发展,现在大多数的单抗和疫苗企业已经普遍采用囊式过滤器,比以前用的滤芯更方便。尤其对新疫苗的开发追求速度,采用囊式过滤器,能够免去前期的安装、使用后的清洗问题,可以节省很多时间,还可以避免安装造成的泄露。

如果希望更进一步方便地保证上下游连接的无菌性,可以采用预灭菌、预组装、即插即用的Transfer Sets的形式——这种滤器从0.05平米一直到27平米,可以全方位实现从小规模的尝试到大规模的生产。再进一步,如果过滤过程中希望满足法规要求,对过滤工艺进行严格的控制和数据记录,则可以采用Flex  Act平台技术对过滤过程中的压力、流速等进行监控和记录。

关于如何选择过滤器。绝大多数的应用场景下我们首先会推荐采用聚醚砜材质的过滤器 ,因为可以满足辐照灭菌的需求,且能极好的跟管路、袋子组合起来,直接做成一次性的无菌产品,非常方便。另外,对绝大多数的应用场景,它的载量和流速都优于其他的材质。这是源自它本身亲水性质的差异,因为醋酸纤维素是亲水性最好的材质,是天然亲水的。

经过澄清之后的料液通常会进行超滤浓缩和换液,这一步会起到三个作用:一是浓缩,二是换液,以便于下一步的层析,三是去除小分子,可以对HCP,DNA和培养基里的小分子起到一个非常好的去除作用。

对超滤技术,首先第一步,需要考察膜材质和孔径的筛选,就是哪种材质和孔径适合您的产品,同时可以考虑到制剂,因为最终制剂换液,也是采用超滤技术,前期也可以进行这个技术的考察,我们要考察不同的缓冲体系对产品稳定性的影响,什么样的制剂处方是适合这个产品的,同时可以考察超滤过程的工艺参数对产品稳定性的影响。

传统的方法,一般会采用超滤离心管或是小型的超滤装置实现。这种方式速度比较慢,一次只能进行一个或几个操作。现在为了加速研发,我们可以采用ambr Crossflow技术有4-16个通道,支持高通量筛选,每个通道可以独立运行不同的条件,只需要5ml以上料液就能实现。前期工艺开发的时候可以实现高通量的超滤工艺筛选和制剂处方筛选。之后做放大工艺的工艺参数确认,可以采用小型的超滤设备,比如Sartoflow系列的自动化、半自动化的超滤系统,确定某款膜包的过滤性能,预测生产规模需要多大的膜面积和相应的工艺时间、流速,生产级别等,可以有不同的考量,其中一种是采用传统的超滤系统,不锈钢的材质,这种最常见,可以采用普通膜包,用碱消毒,然后正常使用,这是非常常规的一种使用方法。

但对其他的有毒性的病毒,其他的有毒性的料液或是考虑到希望过程是完全无菌的,像狂犬、其他的一些颗粒比较大的病毒,是不能进行除菌过滤的。工艺过程中需要实现全无菌操作。这个时候可以采用无菌的超滤组件实现。另外一个选择,就是采用可以进行湿热灭菌的超滤膜包,对系统进行灭菌,保证整个系统全无菌。当然,现在也有很多狂犬工艺是采用碱灭菌。作为微生物负荷控制,并不像灭菌这么彻底。

 

膜包的选择

对膜包的选择,市场上现在主要材质是两大类,一类是聚醚砜,这种有较长的使用历史,另外一种是基于纤维素的。聚醚砜的特点,就是对水性的东西速度较快,另外PH兼容性和耐热性能比较好,缺点则是吸附相对高一些,所以产品收率相对低。

除此之外,容易污染,使用后滤速容易衰减。而基于再生纤维素的,其特点就是亲水性特别好,产品收率好、容易清洗,但传统的普通的再生纤维素有一定的点不耐碱,不耐高温和伽马辐照、有机溶剂。

为了结合这两种材质特点,赛多利斯已经上市了很长时间的Hydrosart材质,是基于普通的再生纤维素进行改造,变成稳定化的再生纤维素,使其同时良好的PH兼容性,可耐受1M的氢氧化钠、蒸汽灭菌、伽马辐照和很多有机溶剂(像苯酚、氯仿等),非常适合疫苗企业的应用,不管是需要使用前进行灭菌或是一次性的无菌膜包的,或是使用前要进行SIP的,等等,都可以实现。

 

关于膜层析

对料液进行澄清、超滤、换液后,最关键的就是提高纯度的步骤,即两到三步的层析步骤。膜层析和传统的填料层析是类似的层析技术,都是基于一定的机制上耦联相应的基团和目标分子相互作用实现分离。

不同的是两者的机制——膜层析的机制是膜,内部有3-5微米的微孔,微孔里会耦联上相应的基团,比如阳离子层析、阴离子层析,耦联上相应的胚基。传统的填料是在基于树脂的微球耦联相应的胚基,胚基可能在表面,绝大多数是在微球里面的微孔里。微孔只有14~40纳米,所以当分子比较小的时候,它可以进入微孔里,载量非常大;但当目标分子比较大的时候,例如病毒或多糖结合疫苗,分子比较大,就难以进入微孔,所以载量会急剧下降,这个时候,膜层析载量要远远超过传统填料的载量。这是膜层析在病毒类产品纯化中的一个优势。

另外一个优势,就是膜层析在速度上,远远快于传统的填料层析。传统的填料一般速度不超过0.5个柱体积每分钟,膜层析可以达到5-30倍膜体积每分钟,这个差距是几十上百倍的差距。同时膜层析还可以一次性使用,从技术上可以进行清洗再生。由于本身像囊式滤器一样的形式,一些情况下可以作为一次性使用,还可以免去清洗验证的麻烦。再一个,本身不需要相应的柱子做前期的装柱操作,可以省去前期硬件投资和前期装柱的操作,使用起来非常方便,也非常契合现在疫苗快速开发的需求。

未完待续……

文 | 赛多利斯工艺平台专家团队

编辑 | 赛多利斯市场团队

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编辑: 刘立东
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