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韩春雨发表基因编辑新论文,发明基于CRISPR的RNA追踪成像系统

仪器信息网 2019/07/18 10:17:22 点击 1035 次
默克工艺
[导读] 近日,韩春雨团队研究开发了一种新型的活细胞RNA追踪成像工具,该基因编辑研究成果发表于预印本网站BioRxiv。这是韩春雨经历基因编辑“风波”后的首次论文发表。


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近日,韩春雨在预印本网站BioRxiv发表了一篇关于基因编辑的新论文:Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE.该研究开发了一种新型的活细胞RNA追踪成像工具——VN-dCasE-VC,效果和可用性更强。该论文署名单位为河北科技大学基因编辑研究中心,通讯作者为韩春雨,第一作者为高峰。

前情回顾

2016年5月2日,韩春雨(河北科技大学)作为通讯作者在国际顶级学术期刊 Nature Biotechnology 杂志发表了题为:DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute(使用NgAgo进行DNA引导的基因组编辑)的研究论文。

该研究称NgAgo对真核生物(包括人)具有基因编辑能力。该研究成功很快在世界范围内爆火,韩春雨老师此前籍籍无名,几乎一夜之间成为学术界网红被赞誉为“在三流学校取得世界一流原创成果,打破国际基因编辑技术垄断”

该论文通讯作者为韩春雨,第一作者为高峰,浙江大学教授沈啸为共同通讯作者,但在后续修改版本中,沈啸从作者名单中去除了。

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2016年8月,河北科技大学成立基因编辑研究中心,计划投入资金逾2亿元。但NgAgo的研究成果引发广泛质疑,2017年8月3日,韩春雨撤回该论文。2018年8月31日,河北科技大学取消了韩春雨所获得的荣誉称号,终止了韩春雨团队承担的科研项目并收回了科研经费,收回了韩春雨团队所获校科研绩效奖励。

2019年4月4日,预印本网站BioRxiv刊登了一篇来自美国普渡大学研究人员的研究论文,表明NgAgo通过核酸内切酶活性介导增强大肠杆菌的同源重组。BioWorld第一时间解读并报道了该论文,该研究表明NgAgo可以编辑原核生物,但不能编辑真核生物基因组

韩春雨最新论文的解读

CasE是Ⅰ-E型 CRISPR复合物的核心成分,它通过结合特定的茎环区域单独处理pre-crRNA,称之为 CasE Binding S,简称为CBS。CasE保守His20参与催化活性,ΔHis26-TtCse3突变的CasE(dCasE)则失去了催化活性,但仍然与其靶标紧密结合。

在该研究中,通过将 split 荧光与dCasE的N端和C-末端(ΔHis20)融合,构建了活体RNA跟踪工具VN-dCasE-VC。该系统仅在存在靶RNA时才发出荧光,从而增强信噪比。

在活细胞中进行可视化的RNA追踪,不需要特定的亚细胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T细胞中的高水平表达和均匀分布表明CasE和dCasE适合于活细胞中的RNA操作。

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为了测试CasE在哺乳动物细胞中表达时是否具有强活性,作者构建了“关闭”报告基因质粒CBS-GFP-N1。它由5'-UTR中的GFP mRNA和CasE结合位点(CBS)组成。当CasE被引入系统时,GFP表达水平急剧下降。

为了进一步测试CasE活性,作者还构建了“开启”报告基因质粒RED-16×CBS-Lin28-C1,其中CBS插入RED单体基因的3'-UTR区和Lin28的上游。Lin28是RNA核保留信号,在其3'-UTR中具有lin28信号的RED单体mRNA几乎不能翻译成蛋白质。

CBS-CasE依赖限制性切断lin28信号并从核释放靶mRNA用于翻译(图1E和图1F)。这些表明CasE可以结合并切割哺乳动物细胞中的CBS

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为了将dCasE-CBS相互作用设计到RNA追踪系统中,作者通过将split-FP5-7与dCasE蛋白结合。发现一个版本,即VN-dCasE-VC很难发出荧光,这可能是由于不正确的折叠或不稳定的状态,但是当与靶RNA(CBS)结合时,可以在荧光显微镜下清楚地捕获荧光信号,即使VN-dCasE-VC表达质粒的转染剂量非常低。

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接下来作者使用VN-dCasE-VC系统追踪哺乳动物细胞中过表达的β-肌动蛋白(β-Actin)的mRNA,VN-dCasE-VC系统在细胞质中显示出强荧光。此外还观察到,向靶mRNA添加更多CBS可改善信号,荧光追踪更清晰,因此,可以通过增加CBS的数量来检测低丰度的mRNA。

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总的来说,韩春雨团队发明了一种新的RNA追踪工具,将其命名为VN-dCasE-VC。该系统能够追踪活细胞中没有背景的特定RNA,通过荧光将其可视化。

目前已有两种活细胞RNA追踪成像工具,一种是MS2,一种是Cas13a,韩春雨团队开发的dCasE系统,成像效果由于MS2,而且,dCasE蛋白的分子量为22kDa,远小于Cas13a的130kDa,dCasE的小分子量更容易递送至细胞内,因此更适合用于活细胞的RNA追踪。

需要特别说明的是,该研究目前发表于预印本网站,尚未经过同行评议。

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通讯作者:韩春雨

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第一作者:高峰

[来源: BioWorld]
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编辑: 刘立东
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