微型光谱仪之荧光检测

　　1、技术简介

　　当常温物质经入射光照射，吸收光能后进入激发态，并且立即激发并发出出射光，那么这种出射光就被称之为荧光。荧光测量是利用灵敏的探测器和高效率的滤光片，将检测样本发出的微弱信号光和高强度的激发光区分出来，并通过探测器对区分出来样本的微弱信号进行检测。

图1 激发荧光原理图

图2 发射荧光能级图

图3 激发波长和发射波长重叠现象

　　2、应用说明

　　荧光激发光谱可以通过有效的荧光激发波长来进行表现，并能够得到荧光转化效率。利用稳定可靠的激发源和发光二极管作为激发光，虽然大多数情况下，激发波长和物质的发射波长会发生重叠，但当一个短波长的激发光在一点激发物质，我们就能在物质发散的其他位置观察到比激发光更长波长的光，以此区分出长波为荧光发射波长，短波段为激发波。

　　荧光光谱学分析对于调查性研究和分析性科学的应用是一个主要的工具。

　　自然环境：宝石鉴定分析，矿石分析，叶绿素分析，原油残留等;

　　法医鉴定：指纹和血液检测，分析纤维组织和其他物质;

　　荧光体温度测量；

　　基础研究：激光诱导荧光研究分子的电子结构和相互作用，燃烧，等离子，以及流体的浓度;

　　生物：分子检测，细胞进程，细胞分类;

　　医学诊断：分析癌症细胞，葡萄糖测定，DNA测序，细胞计数，凝胶电泳。

图4 深海水母的荧光

图5 荧光色素标记的癌变细胞

　　3、典型产品和配置

　　荧光检测配置：

　　3.1 光谱仪：鉴于荧光较为微弱的特性，通常需要高灵敏度光谱仪进行检测，这类光谱往往采用背照减薄型CCD，部分还带有CCD制冷，以保证信噪比。

　　3.2 反射镜: 将更多发散的荧光耦合到光纤内。

　　3.3 聚光透镜：光纤出射的发散光，通过聚光透镜可以形成平行光，使得入射光效率提高。

　　3.4激发光源：激发光源的选择具有多样性，比如LED光源、激光等等。使用LED的中心波长最好接近激发光源波长;所选择激光的强度要能被光谱仪检测到，才能保证发射荧光被检测到。如果使用带宽光源(即连续光谱光源)，需要添加单色滤光片滤出单色光。

　　3.5 滤光片：带通滤光片是窄化激发光源的最简单选择，该滤光片由长通和短通两块滤光片组成，通过调节短通滤光片的位置，可以实现单色激发光。如果荧光物质的激发波长未知，客户可使用可调线性滤光片，可以设置带宽20nm到100nm不等的单色波作为激发波长，还可以单独使用长通和短通滤光片，设置起始波长和截止波长。

图6 带通滤光片光谱图

　　3.6 采样附件(光纤、荧光反射探头、比色皿卡槽等)：模块化的荧光测量系统的优点在于使用单个激发光源和检测器的情况下，获得数据具有建议性、高效性、即时性。通过改变光纤的连接位置，可以实现0°, 90°和180°的不同收光角度进行不同形式的光学测量。使用荧光反射探头，可以直接接触样品表面测量高浓度的液体样品、固体或者粉末，获取样品的荧光散射光。

　　比色皿卡槽，更换其中的透镜可以提高样品荧光的聚集。使用比色皿，可以简便高效率地实现nmol浓度物质的荧光测量。使用配有4通道的比色皿卡槽，由于使用空间耦合的方式，具有高耦合效率。

图7 比色皿卡槽

　　3.7光谱仪控制软件：专用软件可以让使用者更好地使用光谱仪进行各种应用。当使用光谱仪控制软件进行荧光测量时，经常使用到两种测量模式：QuickView mode(快速扫描)和Relative Irradiance mode(相对辐射)。

图8 荧光检测典型配置图

典型产品：高性能微型光谱，激发光源，样品支架

　　4、应用文章

　　4.1 纳米晶体的多个发射峰，成像和定量分析

图9 上转换材料荧光光谱

图10 不同的光源测量核壳量子点发射光谱

　　4.2 不同受力情况下压电陶瓷光谱检测

图11 不同受力情况下压电陶瓷光谱

　　4.3 测量内嵌蛋白荧光的标准光谱工具;

12 牛血清白蛋白荧光光谱(0.1 mg/mL)

图13 溶解酶吸光度光谱(0.1 mg/mL)

　　4.4 硫酸奎宁的荧光检测

图14 硫酸奎宁荧光光谱

　　4.5 切削油的荧光检测

图15 不同样品切削油荧光光谱

　　4.6 使用色氨酸荧光进行溶菌酶的构象分析

图16 磷酸盐缓冲剂天然和变性溶菌酶荧光光谱

 （内容来源：海洋光学）