HALO-2.7 Peptide ES-C18色谱柱技术特性

　　●让多肽的分离实现UPLC性能

　　●适合与UPLC和常规HPLC仪器

　　●HALO-UHPLC分离多肽的新方向

　　快速分离

　　高峰容量

　　坚固，可靠的表现

　　可以用于UPLC和传统的HPLC

　　HALO Peptide ES-C18色谱柱是专门为超快速、超高效分离多肽设计的(图1和图2)。特殊筛选的孔径和ES键合技术使其可以对分子量高达20 kDa的多肽化合物实现良好的分离。更重要的是，该色谱柱利用了fused-core技术可以同时在UHPLC和HPLC的仪器上实现多肽分离的UHPLC性能(图3)。

图1

　　色谱柱：HALO peptide ES-C18 4.6*50 mm（2.7μm）

　　流动相：A：0.1% TFA/10% CAN；B:0.1%TFA/70% CAN;

　　梯度：0%--87.5%B 1分钟

　　流速：5 mL/min

　　温度： 60 ℃

　　压力：330 bar

　　LC系统：Agilent 1100

　　使用HALO Peptide ES-C18 可以实现多肽的快速分离。60s内9种多肽和2种蛋白质可以实现极好的分离。

图2  高分离度

　　色谱柱：HALO peptide ES-C18 2根相连2.1×100 mm

　　流动相：A：H2O/0.1% TFA;B: 80% ACN/ 20% H2O/0.1% TFA

　　梯度：5%--65%B 120分钟

　　流速：0.5 mL/min

　　温度： 45 ℃

　　压力：476 bar

　　LC系统：Agilent 1200

　　样品：Apotransferrin tryptic digest脱铁运铁蛋白

　　图中显示了HALO peptide ES-C18实现高效多肽分离的时间。由于Fused-core技术的低反压，当需要增大峰容量时， HALO UHPLC色谱柱可以用于UHPLC仪器和传统HPLC仪器。

图3 高分离度

　　色谱条件：

　　色谱柱：HALO peptide ES-C18 2.1×100 mm

　　流动相：A：H2O/0.1% TFA；B: 70% ACN/ 30% H2O/0.1% TFA

　　梯度：9%--65%B 5分钟

　　流速：1.0 mL/min

　　温度： 60 ℃

　　压力：476 bar

　　LC系统：Agilent 1200

　　与其他高效的色谱柱相比HALO peptide ES-C18可以实现多肽的UHPLC型的超高分离度。(峰宽对比，HALO的峰宽更窄)

　　HALO UHPLC色谱柱和典型的HPLC或者UHPLC色谱柱不一样。填充的填料是利用Fused-core技术制备出来的，可以实现超快速，超高效的色谱分离性能的 同时避免了UHPLC的一些不足之处。

　　HALO色谱柱借助于Fused-core 填料，所产生的反压明显低于UHPLC色谱柱。这样的低反压可以使仪器承受压力降低，使操作起来更为方便。同时中等的反压可以使HALO色谱柱不仅用于UHPLC仪器，还能用于常规的HPLC仪器。此外，HALO色谱柱所用的筛板的孔径要远远大于UHPLC色谱柱(2 μm vs 0.5 μm)。这样可以减少像UHPLC柱头堵塞那样的麻烦。事实上HALO色谱柱的柱头所用的筛板孔径和常规5微米填料的一样。也就是说，一根5微米填料的UHPLC色谱柱可以轻易实现分离，HALO会更容易。

图4  HALO Fuse-core 填料

　　Fused-core 填料技术是由Jack Kirkland 发明的，可以用来制备快速高样品通量的UHPLC色谱柱而不会损失色谱柱的机械强度和可靠性。正如它的名字一样，Fused-core 即是将多孔硅胶壳熔融到固体硅胶颗粒表面。

　　HALO柱能够产生超快速分离不仅是由于小粒径(2.7 μm)还和在固体硅核表面的0.5 μm的多孔壳层有关。当通过增大流动相流速来

　　加速分离时，低的填料内部的低传质速度会限制分离性能。Fused-core 技术通过减小样品进出固定相的路径长度(0.5 μm)，进而减小了样品在填料内部的时间，实现了快速色谱分离。(图5)

图5

　　HALO peptide C18 填料是特别为分离多肽设计的

　　反相保留需要样品分离在色谱柱填料的键合相进行分配。大部分键合相都是在固定相填料的内表面，而不是在颗粒的外表面。在多孔填料和Fused-core填料的多孔壳层都是这样一种情况。为了实现多肽分子的快速，高分离度分离，孔径得有足够大，进而使得多肽分子进出孔和键合相充分的作用。如果孔径太小，扩散将受到限制，多肽分子将以很宽的峰被洗脱出来，影响分离度。如果多肽分子被孔径所限制，那么Fused-core填料的短扩散路径的优势就发挥不出来。另一方面，如果孔径过大，比表面积将会减小，与多肽作用的键合相也会减小，将会对保留时间，分离度，样品容量和分离柱效有影响。160 A的孔径是针对多肽所筛选的最佳孔径。

图6　　

　　HALO Peptide ES-C18 UHPLC色谱柱中的Fused-core 填料是采用未检测到可于肽作用的金属污染物的高纯硅胶(>99.99%)。这类高纯硅胶颗粒拥有光滑均匀的表面同时含有极少的硅醇基团来和被分离物作用。高的机械稳定性确保填料可以耐高压和高流速。

　　ES键合相产生了坚固和可靠的表现

　　通常反相色谱固定相在酸性低pH流动相条件下会发生键合相水解流失的情况。(图11)这种流失导致保留时间发生改变，分离度将会降低。越低的pH值以及越高的色谱柱温度都会加速固定相上键合相的流失。

　　常用的分离多肽的流动相是水/乙腈其中添加了TFA的梯度洗脱。通常，流动相的pH在2或者更低，并且通过升高色谱柱温度来改善重复性和分离度。不幸的是，这些条件都会加速键合相的流失，减少色谱柱的使用寿命。

　　HALO Peptide ES-C18 色谱柱通过空间保护键合技术抑制了硅氧碱的水解，甚至在高温和低pH的条件下都可以避免色谱柱键合相的流失。这种ES键合技术是通过烷基取代硅烷的大体积侧链产生的空间保护实现了对硅氧键的保护。(图7)

图7

　　HALO Peptide ES-C18 色谱柱填料是采用独特设计的带有大体积侧链的有机硅烷键合技术。这些大体积的侧链基团对硅氧键进行了空间立体保护，使其在常用的多肽分离条件下稳定。

图8 稳定性测试

　　经过775针多肽分离，HALO Peptide ES-C18色谱柱仍然能够保持着良好的重复性，没有发现键合相流失，柱床下沉，柱头堵塞或者其他导致色谱柱无法使用的情况。

　　ES键合技术加上Fused-core 颗粒技术可以制备出可靠的UHPLC色谱柱，甚至在普通色谱柱很快损坏的条件下依然坚固。

　　超纯硅胶，特殊筛选的160 Å的孔径以及ES键合技术产生的填料非常适合分离多肽。结合Fused-core颗粒的固有的速度和分离效率，你将会得到UHPLC色谱柱，近而获得比普通多肽分离色谱柱更高的分离度和更快的速度。

图9　

　　短的样品扩散路径，使得fused-core颗粒可以使用高流速已达到快速分离而不会影响分离度。这些图说明了增加流速后分离度不变。为了保证相同的梯度范围，梯度时间要跟流速相反。

　　固定相基质

　　● 2.7 微米的球，超纯，B型硅胶

　　●1.7微米的硅核加上0.5 微米的多孔硅壳熔融于表面

　　●80 m2/g 比表面积

　　●160 Å 的孔径

　　键合相

　　●立体保护 ES键合C18， 2.0 为摩尔/m2

　　●无封端

　　●pH范围：2-8

　　●最高使用温度：90℃

　　●最大压力：9000 psi，600bar

　　HALO色谱柱技术咨询：

　　通微苏州分公司-苏州环球色谱有限责任公司 李静博士

　　江苏省苏州高新区滨河路1326号125 邮编: 215011

　　电话：0512-68054587、68312081-8022

　　E-mail: info@unimicrotech.com.cn　　

　　附录：HALO色谱柱及熔融核(核-壳)技术简介

　　熔融核技术是由杰克柯克兰(J.J.Kirkland)所发明的。柯克兰教授被公认为是HPLC的创建者之一，并且他的研究和贡献是被色谱界人士广泛认同的。他发表了超过150份主要研究文献和6本书籍。柯克兰博士还拥有30项专利，并且在色谱领域已经获得了很多著名奖项。

　　HALO柱填料不是按照常规方式制作的。相反,HALO UHPLC所填充的填料是利用Fused-core(熔融核/核壳)技术制备出来的，可以实现超快速色谱分离，同时避免了UHPLC的一些不足之处。

HALO 熔融核颗粒

　　Fused-core 填料技术是由 Jack Kirkland 发明的，该类填料最初是为了使得UHPLC色谱柱比常规2μm填料UHPLC色谱柱更坚固可靠。正如它的名字一样，Fused-core 即是将多孔硅胶壳熔融到实心硅胶颗粒表面。

　　HALO色谱柱所产生的反压明显低于UHPLC色谱柱。这样的低反压可以使仪器承受压力降低，使操作起来更为方便。正是HALO柱适度的反压使得他们能用于常规的HPLC仪器却实现近似UHPLC的性能。此外，HALO色谱柱所用的筛板的孔径要远远大于UHPLC色谱柱(2 μm vs 0.5 μm)。这个更大的孔隙柱入口筛板减少了UHPLC柱入口筛板的堵塞问题。事实上,HALO柱的入口筛板不会比常规的填充5μm颗粒的柱子上的筛板小，不可思议吧。

　　“熔融核硅胶柱能减少扩散质路径，允许使用更短的柱子和较高的流速以达到明显的快速高分辨率分离。”

　　——Analytical chemistry，2007年8月