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数字PCR | 基于EVAGREEN®方法的CRYSTAL数字PCR绝对定量检测

仪器信息网 2019/05/20 14:48:05 点击 161 次

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基于EVAGREEN®方法的CRYSTAL数字PCR绝对定量检测

EvaGreen®是一种无致突变性、无细胞毒性的DNA结合染料,NaicaTM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统可兼容EvaGreen®染料进行的数字PCR实验分析。 

反应体系中游离的的EvaGreen®染料不发出荧光信号,但与双链DNAdsDNA)结合后会发出很强的荧光。NaicaTM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统使用检测参比荧光(荧光素钠盐)相同的滤光片可进行EvaGreen®染料荧光信号的检测。 

使用NaicaTM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统,EvaGreen®可以通过使用简单的引物来实现靶标绝对定量。使用我们的Sapphire芯片、基于EvaGreen®的方法可检测低至0.2copiesL

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图1基于EvaGreen®染料方法的基因组DNA绝对定量


对未进行片段化的人基因组DNA进行倍比稀释,浓度范围从1000-0.2copies/μL,使用NaicaTM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统进行绝对定量,使用1.5XEvaGreen®1XPerfeCTa @ UNG Tough mix扩增片段大小为104bpEGFR基因片段。为了保证重复性和稳定性我们进行了三次重复(R2= 0.9977)。在NTC(无模板对照)孔中没有观察到阳性微滴。


EVAGREEN®核酸绝对定量实验的建立

当使用EvaGreen®方法进行数字PCR实验时,需要注意,加入PCR mix的模板dsDNA浓度过高将导致较高的背景荧光。此外,EvaGreen®染料dsDNA具有较高的亲和力,但同时也与存在mix中的寡核苷酸有较低的亲和力,导致背景荧光的增加。 

根据您所需定量的DNA类型和数字PCR反应体系,需要预估实际的动态范围。

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图2:EvaGreen®绝对定量散点图


对未片段化的人类的基因组DNA进行倍比稀释后浓度范围1000-0.2copies/μL,使用NaicaTM Crystal全自动微滴芯片数字PCR仪系统进行绝对定量,使用1.5XEvaGreen®1XPerfeCTa @ UNG Tough mix扩增片段大小为104bpEGFR基因片段。

灰色点阴性微滴,蓝色点阳性微滴。

RFU:相对荧光强度。


[来源:CYCLOUD]
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