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定量蛋白质组学探索新型冠状病毒新疗法

赛默飞色谱与质谱发布时间:2020/03/27 14:55 点击: 加载中..

近期,来自法兰克福大学医学病毒学研究所和歌德大学医学院团队利用一种新颖的蛋白质组学方法对新冠病毒进行研究,加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标,提出新冠治疗新疗法。

治疗选择·细胞层面理解

从2019年底由SARS-CoV-2(2型严重急性呼吸综合征冠状病毒)引起的新型冠状病毒疾病(COVID-19)具有高传染性,该病已发展至全球大流行。全球迫切需要开发抑制病毒感染或复制的疗法。SARS-CoV-2与其他冠状病毒有相似之处,所以目前主要通过对已用于其他适应症的药物库进行高通量筛选,鉴定出许多临床上认可的药物,但却缺乏对SARS-CoV-2感染的治疗选择和细胞层面理解。

法兰克福大学医学病毒学研究所的Jindrich Cinatl教授和歌德大学医学院的Christian Münch教授团队发表最新研究中,建立感染SARS-CoV-2的Caco-212细胞模型,运用一种新颖的多重增强蛋白质动力学(multiplexed enhanced protein dynamicsme, mePROD)方法进行蛋白质组学分析,能够在高时间分辨率下确定转录组和蛋白质组的变化,加速确证病毒致病性相关的生物途径以及寻找潜在的药物靶标。

一、构建细胞感染模型

想要开展该研究的重点取决于两点:1.是否有合适的允许病毒感染的细胞培养模型;2.对蛋白质进行时间感染特征分析的敏感蛋白质组学方法。

该研究建立针对SARS-CoV-2高度兼容的细胞模型,在病毒感染24小时后就能迅速见到细胞致病作用 (图1A)。在病毒感染细胞后的2h、6h、10h和24h,分别用定量PCR技术测量上清液中的病毒RNA拷贝数,发现感染后SARS-CoV-2 RNA数量不断增加(图1B)。这表明模型可以用于研究细胞中SARS-CoV-2。

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图1.  SARS-CoV-2 在细胞内快速复制模型。A, 病毒感染24小时后的细胞形态变化;  B, 细胞上清液中病毒RNA拷贝数的增加

二、翻译抑制剂防止SARS-CoV-2病毒复制

建立好模型,研究人员需要利用一种高效的方法确定SARS-CoV-2感染的时间分布,这时候mePROD蛋白质组学方法应运而生,即基于Orbitrap高分辨质谱仪联用新蛋白代谢标记(SILAC)和串联质量标签(TMT)两种标记方法,进行蛋白差异分析。

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图2. mePROD蛋白质组学实验流程

抑制宿主翻译先前已被用作治疗MERS-CoV等多种冠状病毒感染性疾病。与其他病毒抑制宿主蛋白的合成从而增加病毒蛋白的合成不同,该方法挖掘数据表明SARS-CoV–2仅引起宿主翻译能力的微小变化,作者推测SARS-CoV-2复制可能对翻译抑制更为敏感。通过测试了两种翻译抑制剂,即环己酰亚胺(cycloheximide, 翻译延伸抑制剂)和曲美汀(emetine, 抑制40S核糖体蛋白S14)。在无毒浓度下,两个化合物均对SARS-CoV-2复制产生了显着抑制作用从而发现翻译抑制剂是细胞中SARS-CoV-2复制的有效抑制剂。

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图3. 环己酰亚胺和曲美汀对病毒复制的抑制作用

三、发现潜在的抗病毒靶标

重点来了,通过前期蛋白质组学大数据挖掘,目前一张蓝图已展现在眼前,下一步的重中之重就是探究与病毒蛋白共同增加的宿主蛋白,从而寻求潜在的SARS-CoV-2复制抑制剂。

作者分析了与病毒蛋白变化趋势相似的蛋白,在数据中富集的代谢途径主要由不同的核酸代谢子途径组成。基于此,研究者测试核苷酸合成抑制剂对细胞中SARS-CoV-2复制的影响,高达10 µM的布雷奎纳(brequinar,抑制双氢乳清酸脱氢酶并不具有抗病毒的作用。相比之下,低浓度下的利巴韦林(ribavirine,抑制肌苷一磷酸脱氢酶)即可抑制SARS-CoV-2复制(图4C),这表明利巴韦林是可以进行进一步检测的候选药物。

此外,与蛋白质折叠相关的蛋白变化与病毒蛋白质较为一致,p97是AAA家族的六聚体ATPase酶,也是真核生物最丰富的蛋白之一,通过调节蛋白的稳定性来执行一系列生物学功能,参与膜融合、蛋白降解等过程。测试p97的小分子抑制剂NMS–873对SARS-CoV-2复制的影响。研究表明,NMS–873在低纳摩尔浓度下即可完全抑制SARS-CoV–2(图4D)。

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图4. 核酸代谢相关的蛋白水平与病毒基因表达相关。A, 病毒蛋白随感染时间的变化;B, 宿主蛋白与病毒蛋白关联的GO分析;C, D, Ribavirin和NMS–873的抗病毒实验

结论

全球对于病毒高效治疗方案的需求非常紧迫,深入了解病毒机理及致病性相关的生物途径变得非常关键。定量蛋白质组学是病毒机理研究的主要手段之一,能够提供超高分辨率和灵敏度,可为病毒蛋白质组学研究者所面临的挑战“样本基质复杂、蛋白质鉴定数量不足、假阴性/假阳性结果”提供强大的技术保障。

参考文献:

SARS-CoV-2 infected host cell proteomics reveal potential therapy targets, DOI:10.21203/rs.3.rs-17218/v1


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