偶氮含量的高效液相色谱)检测

1　 仪器与试剂

1.1  仪器
　　液相色谱仪；
　 超声波水浴(4 kHz)；
　　真空旋转蒸发仪(V700)；
　　HWS2型恒温控制水浴(精度±2 ℃) 。

1.2 试剂
　　提取柱：500px×62.5px玻璃柱或聚丙烯柱，能控制流速，填装时，先在底部垫少许玻璃棉，然后加入20克多空颗粒状硅藻土（600度灼烧4h），轻击提取柱使填装结实；
　　芳香胺标准品(纯度均大于98%)； 
　　甲基叔丁醚；二氯甲烷。

2　 溶液的配制
　　0.06 mol/L的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)：取12.526柠檬酸和6.320克氢氧化钠溶于水中，用水定容至1000mL；200 g/L连二亚硫酸钠溶液(用时现配)； 
　　芳香胺混合标准储备液：分别称取21种芳香胺标准品，用二氯甲烷配成1000mg/L的混合标准储备液，低温保存，备用；
　　芳香胺标准工作液：用甲醇将混合标准储备液稀释成60、30、15 mg/L的标准工作溶液，低温保存，备用。

3　 样品前处理

3.1 提取
将样品剪成5mm*5mm的小片，混合。从混合样中称取2.0克，精确至0.01克，置于50ml离心管中入17.0ml稳定为70度左右的柠檬酸缓冲溶液中，并在70度（正负2度）水浴30min。再加入3.0ml连二亚硫酸钠溶液，盖上盖子摇匀，置于70度（正负2度）水浴中保持30min。取出后于2min内冷却至室温。

3.2 净化
用玻璃棒挤压反应器中的试样，将反应液全部倒入提取柱内，任其吸附15min,用40ml甲基叔丁基醚分三次洗离心管内的试样，然后将甲基叔丁基醚洗液倒入提取柱中，控制流速，收集甲基叔丁基醚提取液于100ml比色管中。

3.3 浓缩
　　将上比色管置于真空旋转蒸发仪上，于35度左右的低真空下浓缩至1-2ml，再用氮气吹至近干，用甲醇定容至1ml，过0.45μm 有机相滤头，立即进行液相色谱分析。

4　 色谱条件
　　色谱柱：Vertex C18柱，250mm x 4.6 mm，5μm；
　　柱温：室温； 
　　流动相A：甲醇；
　　流动相B：0.575 g磷酸二氢铵与0.7 g磷酸氢二钠溶于1 000 mL水中，pH 6.0；
 　 梯度洗脱：0～25 min，流动相A由5%线性变化至55%；25～40 min，流动相A由55%线性变化至80%；
　　流速1.0 mL /min；
　　进样体积20μL；
　　检测波长240 nm。

以pH 6.0的柠檬酸盐缓冲溶液模拟人体的汗液环境, 分别加入7.5、15、30 mg/L 3个水平的芳香胺标准品进行回收实验, 每一水平分别做6个平行样品, 相对标准偏差和平均回收率数据见表1。应用高效液相色谱法分离检测了23种混合芳香胺, 取得了很好的分离效果, 满足了国内外相关标准及法规的新要求。