PTI全自动多肽合成仪优化肽核酸的合成

肽核酸(PNA)是DNA和/或RNA的合成类似物，因为整个磷酸二酯键主链被拟肽主链取代，核酸碱基通过甲基羰基连接，具有几种独特的物理化学性质 (图1)。[1]

PNAs是一种非离子核酸类似物，其中性聚酰胺骨架设计可最小化DNA寡核苷酸中经常观察到的非特异性静电效应。因此，短至12个碱基的序列即允许强的特异性杂交，具有改进的序列错配分辨率，比天然寡核苷酸对单点突变更敏感。此外，与天然肽或核酸相比，PNAs对核酸酶和蛋白酶的抗性更强。[2]

PNAs能够通过与互补RNA结合抑制基因表达；在一定条件下，PNAs还可以通过链入侵机制与DNA双链序列结合促进基因表达，从而促进D-loop的形成和相应基因的表达。它们的高亲和力和特异性使它们不仅可以作为治疗药物，而且可以用于诊断。[3,4]

PNAs的合成通常被认为是一个挑战，因为它们容易聚集，并且脱保护步骤通常伴随着副反应。[5]克服第一个问题的策略之一是在耦合步骤中使用大量过量的试剂；然而，合成所需的受N端保护的PNA单体相对昂贵，使得这种方法经济成本偏高。

在本应用笔记中，我们报告了使用全自动多肽合成仪PurePep®Chorus合成PNA的方法优化。以PNA1作为参考序列，评估不同的合成条件：偶联次数、PNA单体过量倍数、反应时间和温度。得到粗品纯度最高的PNA1的最佳条件，然后用于合成其他五个长度和嘌呤(腺嘌呤和鸟嘌呤)含量不同的序列(表1)。后者构成了合成的一个相关因素，因为它们的偶联通常由于偶联单体的位阻困难而导致低产率。

采用低负荷Rink Amide MBHA树脂(0.27 mmol.g-1)，采用Fmoc/tBu正交保护方案，采用PurePep®Chorus (Gyros Protein Technologies)以25 μmol的浓度规模合成PNA1。在室温下，用20%Pip/DMF进行2 × 5分钟的树脂脱保护。偶联步骤是在HCTU和NMM存在的情况下进行的，在所有的合成过程中，条件都有很大的不同(表2)。偶联步骤之后是一个封端步骤，在室温下，用10%的Acetic Anhydride/DMF溶液，反应5分钟。最终脱保护后，用TFA/ TIS/H2O(95:2.5:2.5)溶液在室温下裂解4小时。

通过分析表2可以看出，使用10倍当量的PNA单体可以得到非常好的粗纯度(81%);然而，这种合成方法经济成本高，因为Fmoc保护的PNA单体是昂贵的。通过将PNA的过量倍数降至4 倍当量，粗品纯度会降至72%。在保持低过量PNA单体的条件下，将反应温度提高到45℃，反应时间缩短到5 min，会进一步降低粗品纯度(61%)。由于反应时间5分钟可能太短而无法完成偶联，因此采用相同的条件，但反应时间增加到10分钟(实验D)，得到的粗纯度(82%)与实验A相似，实验A使用了两倍多的PNA单体。E方法采用双偶联的方法，对反应作进一步优化。使用相同数量的原料总当量和相同的时间，粗品纯度进一步提高了5%。

当确定了产生最佳粗纯度PNA1的耦合方案，使用相同的策略(方法E)合成其余序列。结果如表3所示。

合成的PNA序列的粗纯度在66-91%之间，可以认为是很好的粗品收率，特别是对于肽核酸。有趣的是，嘌呤含量较高的PNA序列具有较好的粗品纯度。

在本应用笔记中，我们描述了使用全自动多肽合成仪PurePep® Chorus合成PNA的耦合策略的优化。我们首先在室温下使用10倍当量的PNA单体进行1小时的偶联反应，该策略产生了非常好的粗品PNA(81%)。我们希望减少单体原料的过量倍数，同时尽量减少粗品纯度的损失，使这种反应在经济上更具可持续性和“绿色”。最终，我们开发了一种耦合策略，不仅减少了当量的数量和反应时间，而且产生了比原始策略更好的粗品PNA。通过在45℃下进行双耦合，每次2 倍当量，持续5分钟，我们能够将PNA1的粗纯度从81%提高到87%。最后，将该耦合策略应用于其他序列的合成。该方案应用于具有不同的长度和嘌呤含量的序列，产生了非常好的粗肽核酸。PurePep® Chorus被证明是这项工作的关键工具，因为在PurePep® Chorus全自动多肽合成仪上，从当量、重复次数、反应温度、耦合时间等合成程序均可以很容易地调整。

[1]   P. E. Nielsen, R. H. Berg, Sci 1991, 6, 254(5037), 1497-1500.

[2]   A. Gupta et al., J Biotechnol 2017, 259, 148–159.

[3]   P. E. Nielsen, Chem Biodivers 2010, 7(4), 786-804.

[4]   C. Cordier et al., PLoS One 2014, 9, e104999.

[5]   C. Li, ACS Cent Sci 2022, 8, 2, 205–213.

[6]   D. Al Sulaiman et al., Angew Chem Int Ed 2017, 56, 5247–5251.

[7]   “Low-Scale Automated Synthesis of a PNA-Peptide Conjugate on the Prelude®” (Application Note 12; D0029149/B).

[8]   L. Goltermann et al., Front Microbiol 2019, 10, 1032.

[9]   C. Avitabile et al., Tetrahedron Lett 2010, 51, 3716–3718