CNS前沿文献追踪 – 追踪程序性坏死过程中MLKL行为

细胞的死亡方式多种多样，之前分享过凋亡、铁死亡，这次整理分享一篇关于程序性坏死（necroptosis）的文章，具体内容如下：

如上图，各种因素可以触发程序性坏死，但程序性坏死的关键分子事件是坏死小体的形成：RIPK1和RIPK3形成坏死小体，引起MLKL寡聚、磷酸化，磷酸化的MLKL向细胞膜转位，引起膜损伤，最终细胞死亡（Berghe T V , Linkermann A , Jouan-Lanhouet S , et al. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2014, 15(2):135-147.）

作者关注程序性坏死的效应分子MLKL，追踪诱导剂TSI触发程序性坏死后MLKL的行为：TSI刺激细胞后MLKL寡聚、磷酸化、膜转位，MLKL磷酸化滞后于RIPK3的磷酸化，细胞膜损伤（用LDH释放表征）滞后于MLKL磷酸化

细胞膜损伤（用Annexin V结合表征）后一段时间，细胞才死亡（用PI染色表征）

用识别不同MLKL表位的抗体继续追踪MLKL的行为：未受到TSI刺激时MLKL点状分布；TSI刺激后MLKL聚集成簇（clusters）；TSI刺激后pMLKL逐渐出现，慢慢形成更大的聚集，作者称之为hotspots

观察pMLKL形成的hotspots发现周围有成簇的MLKL；pMLKL形成的hotspots定位在细胞膜（WGA染的是细胞膜）；hotspots形状并不规则

细看MLKL簇：发现MLKL簇周围分布着pMLKL和RIPK1

“抑制”MLKL上游的坏死小体后，MLKL、pMLKL聚集的现象消失

用Mb37封住MLKL和膜互作的位点后，TSI诱导的MLKL、pMLKL聚集、膜损伤现象消失

作者又用NSA封住MLKL和膜互作的位点，发现NSA抑制了MLKL的寡聚、膜转位、pMLKL聚集成hotspots，最终抑制了膜损伤，且NSA加入的越早抑制作用越强，暗示MLKL和膜的互作对于MLKL诱导程序性坏死很重要

MLKL的行为追踪的差不多了，着手看它和细胞死亡的关系，先看看细胞死亡过程：TSI刺激细胞后，细胞膜出现损伤（Annexin V着色），损伤积累到一定程度后膜破损，TOPRO进入细胞

在细胞死亡过程中可以观察到Annexin V出现聚集，对MLKL染色后发现Annexin V聚集在pMLKL形成的hotspots处，暗示pMLKL hotspots处是膜损伤处（和前面的MLKL行为串到一起，分子链条逐渐呈现）

很有意思，作者还观察到了死亡传递：一个细胞发生程序性坏死后，相邻细胞也依次发生死亡

如果将野生型和MLKL缺陷型细胞共培养，在培养体系里加入程序性坏死诱导剂，死亡只能在野生型细胞间传递

故事基本成型，作者又进一步细化一些东西，首先是MLKL如何转位，作者构建了一个筛选体系，用各种抑制剂处理细胞，而后通过读取LDH释放和细胞死亡（PI染色）筛选可能调节MLKL转位的机制，发现是高尔基体-微管-微丝网络调节的（作者将抑制高尔基体-微管-微丝网络的抑制剂组合叫做NCB，NCB并不影响MLKL磷酸化）

验证一下筛到的MLKL转位机制：MLKL、pMLKL的确和微管、微丝共定位，NCB抑制后MLKL簇、pMLKL hotspots受影响

文章并不复杂，只是用细胞成像的方式展现了一下程序性坏死过程中MLKL的行为，看到了点状分布的MLKL聚簇，簇上有RIPK1，pMLKL聚集成更大的hotspots。这种蛋白聚集的行为是否和相变有关呢？TCR信号相变那篇文章有成簇现象，这篇文章中不但有聚簇，还有比簇更大的hotspots，真的值得做一做……

Andre L. Samson, Ying Zhang, Niall D. Geoghegan, Xavier J. Gavin, Katherine A. Davies, et al. MLKL trafficking and accumulation at the plasma membrane control the kinetics and threshold for necroptosis [J]. Nature Communications, June 19, 2020.

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