Tissue Cytometry技术助力天津医科大学于津浦/李祥春团队探索HCC内部巨

肝细胞癌(HCC)是一种侵袭性很强的肿瘤，术后复发率高。免疫检查点抑制剂(ICIs)由于其丰富的淋巴细胞浸润能力而成为治疗肝细胞癌(HCC)的一种很有潜力的治疗方法。然而，由于肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因子，一些HCC患者对ICI治疗反应不佳。因此，迫切需要揭示HCC免疫治疗耐药的分子机制，并开发新的策略来提高ICI治疗的疗效。

‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍2024年4月12日，天津医科大学于津浦/李祥春共同通讯在《Cell Reports Medicine‍‍‍‍》发表题为“Macrophage-coated tumor cluster aggravates hepatoma invasion and immunotherapy resistance via generating local immune deprivation”的研究论文。该研究证明，巨噬细胞包被肿瘤簇（MCTC）通过产生局部免疫剥夺加重肝癌侵袭和免疫治疗抵抗。‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍

通过572例HCC样本，研究人员发现了HCC中的一种独特空间结构组织——MCTC，这种组织与患者的无复发生存率和总生存率的降低相关。从机理上讲，肿瘤源性巨噬细胞相关凝集素Mac-2结合蛋白(M2BP)会诱导MCTC形成，并并在MCTC的边缘捕获免疫活性细胞，从而诱导瘤内细胞毒性T细胞排斥和局部免疫剥夺。用Mac-2拮抗剂阻断M2BP可能是防止MCTC形成、增强T细胞浸润从而提高ICI治疗HCC疗效的有效方法。

实验部分

本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统对HCC样本进行多色荧光图像采集。通过多重免疫荧光技术，结合Tissue Cytometry技术获得了精准的单细胞定量结果以及丰富的组织结构空间定量数据。

‍‍‍‍‍‍Panel 1: CD8，CD68，HepPar-1

Panel 2: CD8，CD163，CD68，HepPar-1

Panel 3: Foxp3，CD163，CD68，HepPar-1

Panel 4：CD68，HepPar-1，Trem2

Panel 5：CD8，F4/80，Pan-CK‍‍‍‍‍‍

作者通过多种细胞的组织原位信息，构建了HCC分类评估系统，发现了MCTC与侵袭性病理特征的关系。

为了探索HCC肿瘤微环境中，与肿瘤作用最强的细胞作用关系情况，文章作者利用StrataQuest软件，对肿瘤簇进行空间定量分析，以10μm为范围，定义了肿瘤最强浸润区间，并研究巨噬细胞与肿瘤细胞直接相互作用，进一步证实了MCTC的预后价值。

Figure 1.HCC组织中发现的MCTC是一个有价值的复发预测因子

(A)HCC组织中四种不同的TAMs空间模式的代表性图像(左)与RFS和OS Kaplan-Meier曲线(右)(高倍比例尺:50 μm;低放大比例尺:100μm)。

(B) TJMUCH队列I中距离肿瘤群0 - 10 μm范围内的TAMs的代表性图像(左)与RFS和OS Kaplan-Meier曲线(右)(比例尺:50 μm)。用于识别肿瘤簇和用于定量分析与代表性图像相同区域的tam的方法详见图S1A。

(D) TJMUCH III队列中MCTC+与MCTC HCC患者的代表性图像(左)与OS KaplanMeier曲线(右)(比例线:100 μm)。

Figure 2.MCTC预测HCC患者对ICI治疗的不良反应中MCTC对照组之间免疫调节基因特征的比较。

(C) 免疫荧光成像显示CD8+ T细胞在MCTC+和MCTC- HCC组织中的分布(比例尺:50 μm)。

作者通过多重免疫荧光染色，使用Strata Quest定量分析软件，证明了在MCTC+ HCC中，细胞毒性T细胞被TAMs战略性地转移到肿瘤周围，有效地阻碍了它们的直接抗肿瘤活性的假设。发现在MCTC+组织中，CD8+ T细胞和Foxp3+ T细胞与MCTC- 组织中的CD68+巨噬细胞和CD68+ CD163+ M2极化巨噬细胞相比，明显更接近CD68+巨噬细胞和CD163+ M2极化巨噬细胞。

Figure 3.MCTC+ HCC的特征是免疫热肿瘤被癌细胞外的大量活性免疫活性细胞浸润

(E) TJMUCH队列IV中MCTC+和MCTC- HCC组织中HepPar-1、CD68、CD163和CD8的代表性免疫荧光图像(比例尺:50 μm)。

(F) TJMUCH队列IV中MCTC+和MCTC- HCC组织中HepPar-1、CD68、CD163和Foxp3的代表性免疫荧光图像(比例尺:20 μm)。

(G) TJMUCH队列IV中MCTC+和MCTC- HCC组织中CD8+ T细胞和CD68+巨噬细胞(左)以及CD68+ CD163+ M2极化巨噬细胞(右)的平均距离分析。

Figure 4.MCTC+ HCC中的巨噬细胞表现出明显的免疫抑制和促肿瘤表型

(H) 免疫荧光图像显示Trem2蛋白在MCTC+和MCTC- HCC组织中的表达分布(左，比例尺:20 μm)，并分析了TJMUCH队列IV中MCTC+和MCTC- HCC组织中Trem2+巨噬细胞的数量和比例(右)。

Figure 5.肿瘤来源的M2BP增强了趋化性和细胞间粘附，诱导MCTC形成

(C) TJMUCH队列III HCC组织中M2BP表达的代表性免疫组织化学(IHC)图像和MCTC状态的相应免疫荧光图像(左)以及M2BP表达与MCTC的相关性分析(右)(高倍刻度条:50 μm;小放大比例尺:100μm)

Figure 6.肿瘤来源的M2BP增强了趋化性和细胞间粘附，诱导体内MCTC的形成

(A) mIF成像描绘了CD8+ T细胞的MCTC结构和分布(左)，以及MCTC计数的统计分析(右)，在皮下植入Hepa1-6NC和Hepa1-6M2BPhi肿瘤的C57小鼠中，无论是否接受GB1107治疗(尺度条:50 μm)。每组N = 5只。

通过对肿瘤组织的多重免疫荧光染色扫描成像发现，CD8+ T细胞主要定位于MCTC的周围，而不在对照小鼠的肿瘤核心，抗PD -1抗体与GB1107联合治疗不仅明显阻碍了MCTC的形成，而且恢复了肿瘤内T细胞的浸润，克服了局部免疫剥夺。

Figure 7.抗PD -1抗体和GB1107联合治疗可通过恢复T细胞瘤内浸润

(A)，在体内显著抑制MCTC+ HCC的生长和转移。在皮下肿瘤植入后的第7、14和21天处死C57小鼠，以评估MCTC形成的时间。提出了两种抗PD -1治疗模型:MCTC形成后和MCTC形成前。在MCTC后形成模型中，肿瘤植入后第14天开始抗PD -1治疗。对于MCTC前形成模型，在植入后第7天开始抗PPD -1治疗，无论是单独治疗还是与GB1107联合治疗。

(B)两种模型皮下肿瘤的肿瘤体积和肿瘤生长曲线的综合概述。每组N = 5只。

(C)两种模型小鼠肺转移结节的代表性H&E染色图像(左，比例尺:100 μm)以及转移结节的定量(右)。每组N = 5只。

(D)两种模型小鼠的MCTC结构和CD8+ T细胞分布的mIF成像(左，比例尺:50 μm)以及肿瘤巢内CD8+ T细胞的定量(右)。每组N = 5只。

Figure 8.肝细胞癌组织中tam的空间异质性

(A) TAM空间格局分类示意图。

(B) MCTC结构在整个组织全景图像中的分布。