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别让你的reads再做布朗运动了,罗氏RNA序列捕获还原真实不同峰度RNA表达!

罗氏诊断发布时间:2014/09/22 22:04 点击: 加载中..

别让你的reads再做布朗运动了

—罗氏RNA序列捕获还原真实不同丰度RNA表达!

 

近年来,遗传变异通过表达水平的改变从而影响癌症、糖尿病、心脏病等复杂疾病的发病日益受到研究者的重视。与之相关的全转录组分析也越来越成为研究热点。

 

    常规的RNA测序(RNA-seq)能检测基因的表达丰度,检测未注释的基因,以及由于剪切而形成的复杂的基因亚型。然而由于转录本的表达丰度宽泛的动态范围,小部分高表达的转录本占据了细胞里大部分的RNA分子,因此在RNA测序的结果里,微量表达的转录本reads覆盖度往往不够,这使得后续的数据分析想要准确的拼接这些转录本或是对其定量简直难上加难。

                                               

图1:传统RNA-Seq面临的挑战:少部分高表达的基因占据了测序数据中的绝大多数reads,而感兴趣的目的基因如果属于低表达基因,其reads量则在测序数据里所占的比例少得可怜。

 

    近日,由FDA牵头的旨在评估RNA-seq准确性、可重复性及信息量的测序质量控制项目(SEQC/MAQC-III)初步结果发表,为评估RNA-seq数据分析提供了宝贵的资源,同时也让人们看到了RNA-seq的短板:对于低表达量的基因,测序结果可重复性低,想要测到这些基因,只能增大测序深度;原本被人们认为是RNA-seq检测优势的可变剪切的检测,由于覆盖junction的Reads太少而变得不靠谱;对于新剪切位点的发现,评估结果显示测得越多,发现的越多,测到1.2Tb reads时仍旧没有尽头̷‧

 

    对于SEQC项目暴露出的RNA-Seq的局限我们并非束手无策,利用靶向RNA-seq能完美的解决以上困扰。对感兴趣的目的基因相关RNA进行靶向捕获后再测序,能够极大的增加测序覆盖度,由此大大提高基因检测的灵敏度、定量能力以及对于微量表达的转录本的拼接能力。

 

    加尔文研究所(Garvan Institute) 的Tim Mercer以及John Mattick近期在Nature Protocol上发表文章,详细阐释了利用罗氏NimbleGen SeqCap EZ Choice 探针捕获cDNA后测序的方法。 他们认为:与全转录组RNA-Seq相比,RNA Capture Seq是一个更加高效的对基因表达进行定性定量研究的方法。Capture Seq的方法除了能准确保留除高表达的基因外的其他基因在原来RNA样本中的相对表达丰度,在样本制备的过程中还可以引入混样(multiplex)的操作方法来提高捕获效率,由此试剂成本也大大降低2。

 

图2. SeqCap RNA 靶向捕获流程,无需专门去除rRNA或进行poly A富集

 

罗氏即将推出的靶向RNA-Seq产品正是基于与加尔文研究所的合作。 SeqCap RNA 序列捕获系列产品包括针对长链非编码RNA的 lncRNA Enrichment Kit,针对小于7Mb或是长达100Mb的任何用户感兴趣的人类RNA区域的捕获产品,以及用户定制的针对长达200Mb非人类RNA目标捕获产品。同时推出的还有一系列与之配套的样品制备试剂与完善的实验流程。届时,研究者还可以通过升级后的在线探针设计软件NimbleDesign快速地自行设计属于自己独一无二的序列捕获探针。

 

    罗氏NimbleGen的SeqCap RNA序列捕获产品将带来更快的实验流程,更真实的实验结果,完美地解决常规的RNA-Seq可能导致的由于目的基因reads数过少而引发的一系列后续数据分析问题。新产品上市在即,敬请期待!

 

1.       SEQC/MAQC-III Consortium. A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium[J]. Nature Biotechnology, 2014.

2.       Mercer T R, Clark M B, Crawford J, et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq[J]. Nature protocols, 2014, 9(5): 989-1009.

 


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