空间代谢组学方法表征肿瘤微环境异质性

徕卡显微系统

2024/05/17 09:31

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肿瘤的发展与肿瘤微环境息息相关。在癌症发生中，正常组织中和谐的细胞相互作用关系被破坏，逐渐演变成适应肿瘤生长的条件。肿瘤微环境的变化，可能导致不同细胞区室的基因、蛋白表达及信号通路的改变。针对肿瘤微环境的检测和表征研究可为癌症治疗提供新的思路。

传统分析技术受取样精确度以及分析灵敏度的限制，无法精准获取靶向部位，而对其中特异代谢物的差异表征就更加困难。激光显微切割技术可以方便地对特定的组织区域精确分离。结合高灵敏度的液质联用检测技术，从而将空间定位准确的微区细胞代谢谱进行全面准确的表征。

实验设计

样品制备：

将肿瘤组织做冰冻切片，样本置于徕卡LMD7激光显微切割载物台；接收端放置PCR管用于分离体的接收。选择合适切割面积 ( ~1,000,000µm²用于代谢物建库；~20,000µm²用于大样本靶向分析)开始进行切割（图1）。切割完成后，小心收集样品。共收集到来自10个病人的原位癌 (25份)、浸润癌 (18份)、癌旁组织 (13份) 样本共46份，每一份在平行的两张张切片上同样位置分别收集作为代谢组学和脂质组学分析。

图1. 组织切片样本用于激光显微切割分离体制备。经过苏木精-伊红（HE）染色确定组织切片中不同类型的细胞区域（左）包括原位癌、浸润癌和癌旁细胞，在平行的未染色组织切片中的相应位置进行激光显微切割获得分离体（右）。

样品提取：

装有样品的PCR管加入50µL提取溶液（代谢组学样本：甲醇:乙腈:水 2:2:1, v/v；脂质组学样本：二氯甲烷:甲醇 1:1, v/v），振荡混匀，超声15 min，离心后将全部溶液转移至进样小瓶中待LC-MS/MS分析。

LC-MS条件：

样品通过ExionLC^™系统分别串联SCIEX ZenoTOF 7600和SCIEX Triple Quad 7500 系统进行代谢物建库和大样本量靶向代谢组学/脂质组学分析。

实验结果：

数据通过SCIEX OS 软件3.1中的定性、定量功能处理。在代谢组学样本中共检出100个代谢物，脂质组学样本中共检出502个代谢物，并将这些化合物在所有的样本进行峰面积提取。将获得的各种组织中化合物含量信息进行生物统计学分析，以浸润癌组织v.s.癌旁组织为例，寻找表征区分这两种组织的差异代谢物。以t-检验p-value值小于0.05以及PLSDA分析VIP值不小于1作为筛选条件，对这两种组织的区分，共找到84个差异代谢物（图2）。