应用呈递丨使用 Clarity OTX 固相萃取 (SPE) 从组织中提取 2′-MOE 硫代磷酸酯

96孔板：Clarity OTX 100mg/孔

货号：8E-S103-EGA

活化：1mL MeOH

平衡：1mL平衡缓冲液 (50mM乙酸铵, pH 5.5)

添加：600µL裂解加载缓冲液到所有样品中

上样：离心振荡约5分钟后加载预处理样品；在RT下再培育5分钟

转移：溶液到TOMTEC或类似设备

淋洗1：3x1mL平衡缓冲液

淋洗2：3x洗涤缓冲液 (50mM醋酸铵, pH 5.5: ACN, 50:50)

洗脱：0.5mL洗脱缓冲液 (100mM碳酸氢铵, pH 9.5:ACN:THF (50:40:10, v/v/v))到收集板

干燥：在温和的氮气流下干燥至约400µL

在分析之前，离心振荡混合样品约1分钟。

色谱柱：Biozen 2.6µm Oligo

规格：100x2.1mm

货号：00D-4790-AN

流动相：

A: 1.0%HFIP, 0.1%DIPEA水溶液, 含10µm EDTA

B: 0.075%HFIP, 0.0375%DIPEA乙腈水溶液(35:65), 含10µm EDTA。

梯度：

梯度斜率: 20-60%B, 1.5分钟内

柱洗: 20-95%B (2x)

流速：0.5mL/min

进样量：2μL

温度：80℃

极性条件：(-)

CAS气体：10

气帘气：20

GS1(psi)：50

GS2(psi)：50

喷雾电压：-4000V

温度：500℃

从各种生物基质中提取寡核苷酸具有挑战性，可能导致低回收率的原因之一是样品预处理，即在均质化和固相萃取之前的组织制备。过去报告中的样品预处理步骤1、2利用的是蛋白酶K，这是一种非特异性丝氨酸蛋白酶，通常用于需要细胞或组织样品均质化的分子生物学应用。独特的是，蛋白酶K在变性条件下得到的结果更好，因此在消化过程中使用非离子洗涤剂至关重要。组织粉碎也遵循文献建议进行，采用基于陶瓷珠的均质化。

在消化和粉碎之后，组织匀浆将更适合于固相萃取，可以像任何其他非固体基质一样进行处理，如血清或血浆。用加标脑组织生成的标准曲线表明，准确度和回收率均高于可接受的水平，所有标准品和重复品的%CV均小于11%。脊髓和大脑的QC样品的结果也很好，具有可接受的低、中、高CV和准确度，如表4所示。内标也获得了一致的峰面积，如图1所示。

由于寡核苷酸结构的复杂性和理化性质，将其从生物基质（特别是固体组织）中提取和清理出来具有独特的挑战。

为了确保从组织中提取寡核苷酸时的回收率和可重现性，必须使用有效的样品预处理策略。这包括用蛋白酶K消化和组织粉碎。匀浆之后就可以像任何其他样品基质一样进行处理，比如直接使用Clarity OTX固相萃取平台进行寡核苷酸的提取。可能还需要对SPE本身进行优化，具体取决于分析物和基质的干扰。