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利用1H-NMR在代谢组学研究中进行生物流体样本的质量评价
2022/03/15 09:54
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方案摘要：
产品配置单：
布鲁克 AVANCE IVDr 高性能及高通量体外诊断 NMR
型号： AVANCE IVDr
产地： 德国
品牌： 布鲁克
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方案详情：
代谢组学研究中标准化的样本处理与加工是获得准确结果的关键。本文阐述了如何利用标准化核磁共振（NMR）技术（例如，基于布鲁克-AvanceIVDr平台）对不同的样本处理方法进行评估，从而对上述观点加以证实。因此，标准化1H-NMR是一种快速、可靠的生物流体样本细微变化监测方法。
代谢组学分析可测量样本中的所有小分子，包括基质、中间代谢物和代谢的最终产物。因此，它可以提供样本采集时身体功能和状态的完整画面。它还能提供有关疾病诊断、预后、治疗监测以及身体对饮食或环境变化的反应的重要信息。
在代谢组学研究中，可以使用任何生物流体，但血液和尿液最为常用，这是因为它们最容易获得。血液和尿液代谢组能反映出被研究的整个生物体的代谢状态，因此会受到健康、疾病和饮食状况的影响。代谢谱分析通常使用核磁共振（NMR）或色谱质谱（LC-MS或GC-MS）来实现。尽管质谱法具有更高的灵敏度，但得益于样本制备、测量和处理的标准化，NMR法更易于操作，且样本制备量最少，重现性高1。
由于样本中代谢物的性质和浓度将构成研究结论的基础，因此所分析的化学成分必须准确反映出样本采集时的状态。工作流程的差异可能会影响所获得的结果，从而增加出现实验室间差异的可能性。因此，准确了解样本处理与加工中的偏差会对代谢曲线产生怎样的影响，以确保高准确度和可重复性分析是非常重要的。
代谢组分析中人工制品的风险
代谢谱可能受活动水平、食物摄入量、外部条件和昼夜节律差异的影响。尽管不可能完全排除这种自然的样本间差异，但通常会在禁食后的一天中的某个时间进行抽样，以尽量减少上述因素的影响。
更可控的是在样本采集和分析过程中引入不必要的变化的可能性。典型的代谢组工作流程包括几个关键活动，每个都与分析前阶段（样本采集过程、持续时间、运输和储存期间的条件）以及分析阶段（样本制备，所用分析技术的精确协议）中的无数可能变化相关联。
代谢组学研究中血液和尿液样本分析前处理的标准操作程序（SOP）被引入，以规范某些变量，如样本制备前的时间或离心方法3, 4。
SPIDIA项目（体外诊断通用预分析程序的标准化）
为了确保代谢组分析的标准化，我们使用核磁共振（NMR）来评估不同分析前处理对代谢组分析用尿液和血液样本质量的影响。最初的研究结果被用作欧洲标准化委员会（CEN）技术规范的基础，最近还进行了进一步的研究（SPIDIA4P——个性化药物体外诊断通用预分析程序的标准化）。
选择NMR作为分析方法来进行这些分析，是因为它能提供高重复性、高通量的数据，因此可以可靠地比较不同预分析处理的效果。
禁食血样是从达芬奇欧洲生物银行的存储库中获得的6。将健康受试者的尿样（禁食条件下的早晨第一次尿液）在2-8°C下储存，采集后2小时内进行分析。使用不同的离心和过滤处理方法对每个样本进行分离与分析7。采用布鲁克 AvanceIVDr 600 MHz系统，并遵循样本制备与分析的标准操作规程，获取所有样本的1H NMR谱。
尿代谢谱改变的根源
尽管除细胞外只有少量的酶存在，但正在进行的化学与酶反应也可能改变尿液的成分。事实上，在处理过的和未处理过的尿样中都检测出一些信号强度以及新代谢物的出现7。通常，乙酸酯、琥珀酸盐和肌酸盐会随时间而增加，丙酮酸盐、肌酐和2-氧戊二酸盐则会减少。
变化的主要根源是氧化还原反应，虽然不能完全避免，但通过在整个分析和预分析过程中使样本保持在低温下并减少与空气接触可以尽量减少这种反应。叠氮化物在NMR缓冲液中的存在不影响这些变化的程度。储存在-80℃的样本在保存5年后仍然完好7。
血清与血浆
红细胞的活性会引起重要代谢物的浓度变化，如葡萄糖、乳酸和丙酮酸，因此样本应在采集后30分钟内进行处理以去除细胞。与尿液一样，氧化反应也会引起变化，从而影响其它代谢物的浓度，如脯氨酸和柠檬酸盐7。同样，在整个分析和预分析过程中使血液样本保持在低温下也能减少其成分的变化。储存在-80℃的血液样本在保存5年后仍然完好。
此外，Ficoll梯度离心法已被证明会强烈干扰血液样本的代谢谱，遮掩重要的代谢物，包括葡萄糖和乳酸7。使用EDTA和柠檬酸盐时，谱信号丢失较少。
总的来说，这些最新结果进一步证实了CEN建议文件的有效性。此外，作者还证实了1H-NMR是一种快速、可靠的样本质量评价与样本处理、储存过程验证方法。
参考文献：
1. Markley JL, et al. Curr. Biotechnol. 2017;43:34e40
2. Giskeødegård GF, et al. Sci. Rep. 2015;5:14843
3. Bernini P, et al. J. Biomol. NMR 2011;49:231 243. https://doi.org/10.1007/s10858-011-9489-1
4. Emwas A-H, et al. Metabolomics 2015;11:872–894. https://doi.org/10.1007/s11306-014-0746-7.
5. Takis PG, et al. Trac Trends Anal Chem 2019;120:115300 https://doi.org/10.1016/j.trac.2018.10.036.
6. Ghini V, et al. Metabolomics 2015;11:1769–78. https://doi.org/10.1007/s11306-015-0832-5.
7. Ghini V, et al. New Biotechnology 2019;52:25–34. https://doi.org/10.1016/j.nbt.2019.04.004
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