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关键质量属性实验“红宝书”,这篇干货足够多!

安捷伦发布时间:2019/01/22 11:27 点击: 加载中..

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某化学分析专业正在举行“关键质量属性”答疑课,

课代表负责整理好教授答疑内容,

课代表认真的把问题和教授给出的答案写到了小本本上......

带你窥探一下课代表的笔记吧!这本“红宝书”干货足够多!

 SEC 分析、糖谱分析、氨基酸分析、滴度测定、电荷异构体、多肽药物分析,最实用的实验操作宝典都在这里啦。

认真读完下面 Q&A, 篇尾扫描二微码,可获“终极宝典”!

SEC 分析部分

Q1 :一定要做 SEC 分析嘛?

A: 聚集体含量影响药物的安全性与有效性。聚集体分析是CQA分析中非常重要的项目。聚集体分析主要使用SEC手段。

Q2:SEC 分析如果不能够选择合适的色谱柱和流动相会遇到哪些问题?

A:主要的四个问题:分离度、回收率、准确度、色谱柱的使用寿命。任何一个考察项不够好,那这个方法的整体重现性不会好,色谱柱的批次重现性会反影响实验结果。通常建议进样体积不大于色谱柱体积的5%。

Q3:SEC 分析实验操作都要注意哪些关键细节?

A: 使用不会影响样品的流动相,首先考虑使用 150 mm 磷盐酸缓冲液( pH 7.0 )进行分析,高通量分析可以选择 150 mm 色谱柱长,如果需要提升分离度,可以选择两个色谱柱串联,SEC 需要小进样量以保证分离度,通常建议进样体积不打一色谱柱体积的 5%,色谱柱使用压力控制在小于 200bar,流速的建议范围是 0.6-0.8ml/min 的流苏范围,但是需要考虑分离时间。

关于糖谱分析

Q1:为什么糖基化很重要?

A:因为会影响到药物的安全性和药效

Q2:为什么要对多糖进行标记?

A:引入紫外或荧光的发色基团,提升多糖的分离度,如果不标记峰会裂分,最后是为了增加质谱的灵敏度。

Q3:切糖后净化需要几步?

A:亲水 SPE 的原理,把小柱用高比例的乙腈去平衡,注意水相的比例不要太高,之后上样,然后用 96% 乙腈来清洗三次把其他杂质去掉,最后洗脱的时候用 1% 甲酸在水相中洗脱,最后一步需要低温干燥,通常这一步需要过夜。

Q4:有必要做两次的净化嘛?

A:很多人在做了第一次净化之后不做最终的净化步骤,这样会在上液相的溶液中会有比较高的 2-AB 残留,可能影响到最初的流出,所以对结果是可能产生影响的。

Q5:重现性不好是 HILIC 通病?如何优化?

A:至少运行 5-10倍 以上的柱体积进行再平衡,只要有充分平衡的时间,重现性的问题可以得到优化。

Q6:糖谱分析中会遇到灵敏度不好的问题,怎么办?

A:建议大家如果使用安捷伦的 FLD EX,建议大家设置激发波长设置为 260 纳米,发射波长为 430 纳米的设置。

Q7:对于采样频率的设置有什么建议嘛?

A:建议大家对二十分钟的采样频度至少放置到 5 Hz 左右,以防色谱峰偏胖和塔板数过高,但是不能一味的提升 Data rate,需要根据这贞的平均峰宽而定。但是不能一味提升 Data rate,较高的 Data rate 也会伴随较高的基线噪音波动。需要考虑实验的平均峰宽和信噪比。

Q8:如何实现希望提升灵敏度但又不提升进样体积?

A:建议是换一个弱一些的 HILIC 溶剂,这样可以让峰型比较理想。

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氨基酸分析

Q1:为什么要做氨基酸分析?

A:氨基酸是蛋白质的基本组成单元,所以测定氨基酸有重要意义。蛋白与多肽的鉴定和定量是必须做的,FDA 有法规要求做氨基酸,能够有效监控细胞培养基成分及代谢中间产物。

Q2:氨基酸分析中有哪些建议及注意事项呢?

A: 建议每天都更换新的衍生试剂以及 buffer 以及氨基酸标样,这样可能让人觉得很浪费。我们建议在收到新鲜的试剂盒之后先把衍生试剂和标样之后小体积分装,然后冻存就可以有效的避免浪费。建议每天校正保留时间及相应。定期检查分析柱及预柱的性能。建议每两天更换新鲜的流动相。如果压力升高建议首先考虑更换预柱,预柱就是起到保护分析柱的作用的。

滴度测定与电荷异构体分析

Q1:滴度测定如何获取更准确的定量结果?

A:使用适当的 Data rate,可以有效提升峰高及灵敏度。当 Data rate 不断升高的时候,峰高也明显增高,如果希望方法获得更好的灵敏度,就适当提升 Data rate,推荐至少放到 10 Hz,尽管做了高波长设置,但是基线从100% A 相到 100% B 相依然会出现扰动,B 相使用 0.5M 乙酸做流动相,很容易配,做低浓度标曲测定非常有必要做空白扣除的工作,以此获取更准确的定量结果。

Q2:IEX 注意事项:

A:确保系统有足够的惰性,这会对结果的稳定性有很大的影响,推荐Agilent 1260 Infinity或者采用全新的毛细管流路连接设计来优化这个问题,不同起始盐浓度对分离结果,盐浓度越高系统越快;流动相pH值越低,结合力会越强,洗脱会更费力一些。

Q3:cIEF 与 IEX 哪个更好些?对应性如何?

A:cIEF 的分辨率高于 IEX 一个数量级,但是 IEX 可以做制备,对于酸峰碱峰的认定的进一步鉴定方面IEX更有优势。cIEF 和 IEX 的对应性,往往没有办法达到预期,IEX 的酸碱峰分离有时候会不太理想,这是因为 IEX 时仅仅是表面电荷起作用。


多肽类药物分析

Q1:利用色谱做多肽类药物分析主要的影响因素有哪些?

A:主要的要素有:化合物/样品性质(酸碱性、极性、样品基质、PI 值)、流动相(缓冲盐、PH、两相比例、有机相种类、分离模式)、固定相( pH 耐受性、选择性、作用机理,其他固定参数)、仪器系统(选择 HPLC 还是 UHPLC )、柱外效应、柱温。

Q2:多肽类药物分析的核心指标是什么?

A:分离度是需要关注的核心指标。影响分离度的三个参数分别为:塔板数;保留因子,选择性。塔板数与保留因子越大,分离度越好。而不同的选择性(主要来自于键合相和流动相两方面)可能对分离结果产生显著影响。

Q3:那么反相色谱分离度最重要的影响因素有哪些?有什么建议嘛?

A:反相色谱获得满意的分离度最重要的三个要素:一根塔板数足够高的色谱柱,合适的流动相及优化的梯度(选择流动相时不要用 TFA 体系,水相选择纳盐而不是钾盐或铵盐,初始浓度建议首先尝试 50mM。有机相选择乙腈而不是甲醇,水相 pH 初始建议在主成分 pl+-1.0 附近,使用 buffer advisor 获得稳定重现的流动相配制),优化的液相色谱管路(接头)及检测器参数。

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