qTOWERiris UV通道助力膜蛋白热稳定性分析

在上期文章中，我们提到了CyBio FeliX基于Cube Biotech NativeMP^TM技术的全自动PlateX MP^TM试剂盒膜蛋白纯化应用（回看链接：CyBio Felix高效助力自动化细胞膜蛋白纯化），在完成膜蛋白纯化后，可以对纯化后的膜蛋白保存条件、膜蛋白与配体的相互作用等进行分析，常用的分析方式为膜蛋白热稳定性分析，也叫膜蛋白热漂移检测（Thermal shift assay）。

膜蛋白的热稳定性是功能表征、结构解析和药物开发的关键参数，测定溶解温度（Tm）的变化是分析蛋白质热稳定性的经典方法。常用的SYPRO^® Orange荧光染料可通过结合蛋白热变性后暴露的疏水区域，实现对蛋白质解折叠的灵敏检测。然而，SYPRO^® Orange的本底荧光较高，特别是在膜体系（如脂质体、去垢剂溶液）中容易发生非特异性结合，导致背景信号干扰，可能会因背景噪声导致拐点模糊，难以准确计算Tm值，降低检测灵敏度，因此，SYPRO^® Orange染料不适用于膜蛋白的热稳定性检测。

      CPM染料（7-二乙氨基-3-(4'-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素），已被证明是一种进行膜蛋白热稳定性分析的更合适的荧光染料，该染料在结合膜蛋白的巯基后，荧光量子产率显著提升，且未结合的染料背景荧光强度极低，信噪比更高，尤其适合低丰度膜蛋白的热稳定性检测。然而，由于CPM染料的激发光波长在近紫外区间，要对其进行有效检测需要检测仪器的光学系统提供近紫外UV-A范围的激发光，同时在其发射光谱范围内进行检测。

德国耶拿公司的qTOWER iris是一款全光谱实时荧光定量PCR仪（图1），配备专用的UV检测通道。结合仪器精确的温度控制，能够满足CPM标记对膜蛋白进行灵敏且可靠的热稳定性分析。

图1. 德国耶拿公司qTOWERiris实时荧光定量PCR仪

在本应用中，利用荧光染料CPM进行膜蛋白热稳定性分析，使用高通量qTOWER iris 384荧光定量PCR仪配备UV通道 （该应用同样适配qTOWERiris 96通量），在不同pH水平和不同盐浓度缓冲液条件下进行检测。

在qTOWERiris 384进行膜蛋白热稳定性分析的优势主要体现在：

配备375 ± 15 nm激发光和475 ± 15 nm发射通道的UV通道，完美匹配CPM等UV染料的激发/发射特性；

高性能光学系统可检测微小的荧光强度变化，确保对蛋白解折叠过程中细微构象变化的捕捉；

配温度控制精确且均一，温度准确性±0.1℃，温度均一性±0.15℃，可获得可靠的Tm值；

在保持数据质量的前提下实现高通量筛选，适合药物发现中的大量化合物评估。

qTOWER iris系列实时荧光定量PCR仪具有特殊的紫外检测通道，能够快速且精确地评估膜蛋白质热稳定性。实现高效筛选保存条件以最大化膜蛋白质稳定性，并评估小分子化合物、配体等对膜蛋白的影响。高性能光学系统可检测微小的荧光变化，而样品模块精确且均一的温度控制能够获得可靠的溶解温度，同时，搭配的qPCRsoft分析软件中的溶解曲线分析可直接获得Tm值，分析其变化情况，操作快捷方便，协助实验人员快速获得实验结果