荧光分子中分子浓度、大小和相互作用检测方案(共聚焦显微镜)

Technique and Method技术与方法Progress in Biochemistry and Biophysics 王柱楼，等： CorTectorM SX100： 一款桌面式荧光相关光谱仪的原理和应用2018； 45 (11)·1167· 生物化学与生物物理进展PIBB 2018，45(11)：1166~1177 www.pibb.ac.cn CorTectorTM SX100：一款桌面式荧光相关光谱仪的原理和应用* 王柱楼 康 宁 梁艳琴 肖 茜、** 黄韶辉** (中国科学院生物物理研究所，交叉科学所重点实验室，北京100101) 摘要 荧光相关光谱检测技术具有超灵敏(单分子)、快速(数秒至数分钟)和多功能(检测分子浓度、大小和相互作用)等技术优点，且无需反应物分离，因此有潜力成为一种新型均相、高敏荧光免疫检测技术，适用于在溶液中或单个活细胞内检测生物分子特性.本文首先介绍荧光相关光谱检测技术的原理和研究进展，然后结合项目团队自主研发的目前全球唯-一一款可靠、易使用的桌面式荧光相关光谱仪，进一步探讨荧光相关光谱检测技术的具体实现和潜在应用. 关键词 荧光相关光谱学，荧光自相关，荧光交相关，单分子荧光 学科分类号Q6 DOI： 10.16476/j.pibb.2018.0058 荧光相关光谱学 (fluorescence correlationspectroscopy， FCS)是美国科学院和工程学院两院院士 Watt W. Webb 教授与同事在1970年代建立理论基础并进行实验验证后建立起来的3].进入1990年代，随着显微镜、激光器、计算机、数据采集卡、光子探测器、荧光分子和标记技术的巨大进步， FCS 技术才具备软、硬件条件并首先在科学研究的各个领域得到了广泛应用[4-6，仅在 PubMed论文库中用“fluorescence correlation spectroscopy”关键词进行检索，就得到近7000篇学术论文.FCS及其衍生技术已经被应用于单分子研究、分子-分子相互作用研究、化学反应动力学、病原体检测、酶活性检测、纳米颗粒特性分析、光物理学、等离子纳米光学和微流控技术开发等.然而中国学术界目前对该技术了解还较少，只有少数几个实验室应用了这一技术，可能原因有： a. 商业荧光相关光谱仪目前由国外高端显微镜厂商垄断，仪器售价及后续维护费高.以德国Zeiss 公司的 Confocor 产品系列为例，基于共聚焦或多光子显微镜的荧光相关光谱仪(Confocor 3)售价可达50~100美元元，整套系统需配置显微镜实验间和专业操作人员，年维护费可达售价的10%. b.少数具光学、物理学背景的实验室可自主搭建低成本的 FCS 系统，但在普通生物医学、化学实验室中搭建、维护和应用此类系统的难度很大. c. 荧光相关光谱学原理较复杂，实验操作和数据分析需要对干扰因素和技术原理有全面和深入的了解，因此 FCS 技术的推广难度较大. 基于以上分析，项目团队开发了目前全球市场上唯一一款低价、可靠、易使用的桌面式商业荧光相关光谱仪(CorTectorM SX100).该仪器无需独立显微镜实验室，适用于研究溶液样品中的分子特性，可在生物医学、化学、物理学等学科的普通实验室中推广应用. 荧光相关光谱学基本原理 FCS 技术的关键是在一个宏观溶液样品中，利 ( *广东省科技计划项目资助(20140215). ) ( **通讯联系人. ) ( 黄 韶辉. Tel： 010-64887732， E- m ail： shaohuih@ibp.ac.cn ) ( 肖 茜 . Tel： 0 10-64887732， E - mail： qianxiao@moon.ibp.ac.cn ) ( 收稿日期：2018-02-10， 接 受日期：201 8 -07-17 ) 用激光和光学器件非接触性地分离出一个极小的荧光激发和检测体积V(图1)..该体积通常只有数个飞升(1fl=10"L；约一个细菌大小)，包含几个至几百个基于布朗运动而自由扩散的荧光分子或经过荧光标记的分子、纳米颗粒等.受检荧光分子的浓度在溶液样品中是恒定的，但在微观体积V内的荧光分子个数 N(t)因自发的热力学不平衡而随时间t波动8N(t)， 进而反映在相应的荧光信号 F(t)及其波动8F(t)上.因此： 尖括号代表时间平均值.在微观体积V内以 小概率随机存在的分子个数N(t)由泊松统计学(Poisson statistics)原理决定，因此分子个数的方差8N(t)}等于其平均值/(F(t)>2)从而推导受测分子溶度C. 因此， FCS 技术从本质上就是一种超灵敏检测方法. Fig.1 Schematic illustration of the principle of fluorescence correlation spectroscopy (FCS) Fluorescent molecules N (t) freely diffuse through the FCS volume V at time t. The spontaneous thermodynamic fluctuations of the number offluorescent molecules in the FCS volume Vlead to corresponding fluctuations in the recorded fluorescent signals F(t). The experimental measurementsof the time-averaged fluorescence intensity and its temporal fluctuations 8F(t) reflect respectively the average number of fluorescent molecules and its temporal fluctuations 8N(t) in the FCS volume V. FCS 技术需要在溶液样品中分离出一个极小的荧光激发和检测体积，而基于点扫描三维成像的共聚焦或多光子荧光显微镜的高分辨率也取决于在一个极小样品体积内激发和检测荧光信号.因此，现有商业荧光相关光谱仪都是在共聚焦或多光子荧光显微镜上实现的(图2a).激发荧光分子的激光(绿线)被显微镜镜头(OBJ)聚焦到溶液样品(S)中的一个极小的体积内(聚焦点：图2b绿色区域)；；聚焦光路(包括聚焦点)内的所有荧光分子受激产生荧光信号(红线)，这些信号的一部分被同一显微镜镜头(OBJ)收集，经过二向分色镜(DM)反射、成像镜 (TL)聚焦和滤光片(F)过滤，最终被单光子计数荧光探测器(DET)接收；为了在聚焦点内分离出一个更小的荧光检测体积V(图2b橙色部分)，在与聚焦点相对应的成像点放置一共聚焦针孔(P)；通过调节该针孔的大小，使得只有从检测体积V内发出的荧光信号才能被探测器接收到.理想状态下，单个荧光分子自由扩散经过体积V时，可产生背景噪声为零，脉冲形状可用二维高斯分布公式描述的理想脉冲信号(图2b).但是在实际操作中，由于背景信号和探测器噪音等因素，实验测得的是更为复杂的波动荧光信号 F(t)(图2b). Measured fluorescence signal F(t) Fig. 2 Principles of auto- and cross-correlation analysis (a) Fluorescence correlation spectrometer based on a confocal optical pathway. (b) Fluorescence excitation (green) and detection volume (orange) V in asolution sample with fluorescence signals F(t) detected from this volume V. (c) Schematic illustration of fluorescence auto-correlation analysis： r iscorrelation time； G(0) is the correlation amplitude with r=0， Tp is diffusion correlation time. (d) An example of experimentally acquired autocorrelationdecay curve. (e) Schematic illustration of fluorescence cross-correlation analysis (FCCS). (f) An FCCS experiment yields two auto-correlation decaycurves (green and red) and one cross-correlation decay curve (black). DET： Single-photon counting fluorescence detector； DM： Dichroic mirror； F： Filter； OBJ： Objective； P： Pinhole； S： Sample； TL： Tube lens； V： Fluorescence detection volume. 1.1 荧光自相关技术的原理和应用 荧光自相关光谱(fluorescence auto-correlationspectroscopy)是最早开发的 FCS 技术.自相关分析就是计算波动荧光信号F(t)与自身在相关时间r(correlation time)的时滞信号F(t+T)之间的重叠程度，即自相关幅度 G(r)B，7： 其中8F(t)=F(t)-0时，两组信号之间的重叠区域随值的增加而减少， G(r)下降；当T→o时，两组信号之间无重叠区域， G(…)=0(图2c). 同样的，对实验所得波动荧光信号 F(t)进行自相关计算，可得到随相关时间r增长而衰减的自相关幅度 G(r)(图2d，黑色数据点).对这些实验数据进行拟合后(图2d，红色曲线)得到的拟合参数G(0)和 r(diffusion correlation time)分别反应了受测分子的浓度和大小(附录1). 利用荧光自相关技术可在溶液中或单个活细胞内定量分析分子-分子相互作用，，比如测定抗原-抗体结合反应的亲和力K，值值： Ag*为经荧光分子标记的抗原分子， mAb 为其特异性单克隆抗体， Ag*-mAb 为抗原-抗体结合物.如果抗体 mAb 与抗原Ag 分子质量比值超过8， FCS 技术能在均相反应液中定量检测游离态和结合态抗原分子的浓度[Ag*]和[Ag*-mAb](附录2).通过系统性地改变反应液中[Ag*]/[mAb]比例，并测定相应的[Ag]、[Ag*-mAb]摩尔浓度， FCS 可测定该抗原-抗体结合反应的解离常数K，值(图7c). 1.2 荧光交相关技术的原理和应用 然而并不是所有的分子间相互作用都发生在分子质量/体积悬殊的两者之间.因此，在荧光自相关光谱技术的基础上又发展了荧光交相关光谱(fluorescence cross-correlation spectroscopy， FCCS)技术[6，9]. FCCS 技术可在共聚焦光路上实现，通常需要2个不同波长的激光器和与之对应的2个荧光检测通道.这2个激光器被用于激发溶液样品中2种被不同颜色的荧光分子标记的受测分子(M、M，).这2种分子自由扩散经过相应的荧光检测体积V和V时分别产生F(t)和F(t)两种随时间t波 动的荧光信号(图2e，红色和绿色曲线).以单个红色或绿色荧光分子产生的理想脉冲信号为例，假设V=V=V并且V和V在三维空间重叠.如果两种荧光分子之间无相互作用，那么两种分子通过自由扩散进入检测体积V的时间是相互独立的，相应的荧光信号通常不在同一时间t出现(无交相关性).而当这两种分子形成稳定的分子复合物(M-M，)因此同时进入荧光检测体积V时，红色和绿色荧光信号被同时探测到(有交相关性)，这两组荧光信号在相关时间r的交相关幅度 Gx(r)可由公式(4a)计算(图2f；黑色曲线)[69： 针对红色和绿色波动荧光信号分别进行自相关分析可得到相应的自相关幅度 G(r)和 G(r)(图 2f；红色和绿色曲线)： 运用特定的数学模型(附录3)对实验所得荧光交相关幅度进行拟合，可得拟合参数值 Gx(0)和Txp.与自相关分析类似， Gx(0)与 TxD分别反应了分子复合物[M-M，]的摩尔浓度和大小[69，参照体外医疗检验(in vitro diagnosis)最常用的“夹心法”，可以用两种经不同同色荧光分子标记的抗体 mAb *和mAb，来设计一种针对特定疾病标记物(抗原Ag)的均相荧光免疫检验法： 通过对一次 FCCS 实验所得的两条荧光自相关和一条荧光交相关衰减曲线(图2f)进行拟合并得到相应的 Gx(0)、Gi (0)和 Gz(0)值，疾病标记物[mAbj*-Ag-mAb，]浓度 Cx可由公式(5)计算得到： 如上所述，荧光交相关检测有以下优点： a.受测分子本身无需荧光标记；， b. 受测分子体积大小无限制但需要被两种抗体同时识别； c. 可使用饱和(经荧光标记的)抗体浓度(nmol/L)来检测极低浓度(fmol/L~pmol/L)的疾病标记物.然而，实现 FCCS技术需要： a.对两种抗体分别进行两种不同颜色(荧光发射光谱完全分离)的荧光分子标 记；b.通常需要两个激光器来分别激发这两种荧光分子，并且相应的两个荧光检测体积大小类似(V≈V)且在三维空间上高度重叠.因此，荧光交相关技术相对于荧光自相关技术有更大的实现难度. 1.3 荧光相关光谱技术优点 在特定实验条件下检测分子浓度、大小和相互作用是生物医学和化学研究的主要课题.如上所述的 FCS 和 FCCS 技术能在溶液环境中或单个活细胞内定量检测分子的浓度、大小和相互作用，因此在生物医学、化学等研究领域具有无可取代的综合技术优势：a.超灵敏，最高检测灵敏度是单分子，适用于检测极低浓度(pmol/L~nmol/L)的溶液样品；b.微量，荧光检测体积小至数个飞升，因此溶液样品或单个活细胞体积也可以非常小(数10个微升)，适用于检测非常少或非常珍贵的样品；c. 快速一次检测只需几秒钟至几分钟； d.多功能，，次检测可同时获取分子浓度、大小和相互作用的定量信息；e.均相检测，可在保持生物分子活性的溶液中或活细胞内直接检测分子特性，无需将受测物分离提纯(均相). 2 桌面式荧光相关光谱仪的研制 现有的商业荧光相关光谱仪在共聚焦或多光子显微镜的基础上开发，因此体积大、价格高、需 要显微镜暗室和专业操作人员.而实验室搭建的荧光相关光谱仪对操作者的专业技能，特别是共聚焦光路调节能力要求高.因此，为促进 FCS 技术在普通生物医学、化学实验室中的推广应用，本课题组历经4代工程样机(图3a~3d)研制，成功开发了目前全球市场上唯一一款自动化程度高、性价比高、并且整合了 FCS 和 FCCS 技术的桌面式荧光相关光谱仪(CorTectorTM SX100；图3d).与传统的基于商业显微镜的荧光相关光谱仪相比，该设备进行了多项技术创新： a. CorTectorM SX100 的所有子系统，包括共聚焦光路、电子与机械系统、光密样品仓等，都被整合在一个 733 mmx410 mmx349 mm体积内.因此， CorTectorTM SX100可在普通实验室的桌面环境中使用. b.荧光相关光谱仪的技术难点是实现对共聚焦针孔(图2a)的精确、、可重复定位.因此，CorTector'M SX100 为2个荧光探测通道的每一共聚焦针孔(图4)都配置了3个伺服-步进电机并开发了相应控制软件，从而实现了对共聚焦针孔在三维空间内的全自动、高精确(约1um)定位. c. CorTectorM SX100 配置了电机驱动三维定位样品台，目前已实现对8个溶液样品的批量、自动检测. d.项目团队自主开发了数据采集(correlation acquisition)和数据分析(correlation analysis)软件，在很大程度上减轻了实验者的工作负担，并可根据具体实验需要开发相应的软件任务包. Fig. 3 Development of the bench-top fluorescence correlation spectrometer (a) The first generation proof-of-principle prototype. (b) The second generation prototype. (c) The third generation prototype. (d) The fourth generationprototype (i.e.， the first generation commercial product： CorTectorMSX100). 2.1 硬件实现 CorTectorTM SX100 荧光相关光谱仪的硬件系统如图4所示，主要包括四部分：荧光激发系统、样品检测系统、荧光检测系统和数据采集/分析系统.两个激光器(488 nm、638 nm)产生的两束激发光经波分复用器(WDM)耦合入一根单模光纤(SMF)， 经光束准直器(BC)转为空间准直光，然后经激发二向色镜(ExD)反射入显微镜物镜后瞳并被聚焦至溶液样品内.样品经激光激发产生荧光，部分荧光被同一物镜收集并以准直光从后瞳射出，经激发二向色镜(ExD)过滤激发光.不同波长的荧光(红色和绿色)通过发射二向色镜(EmD)分离和滤光 片(EmF)过滤后，被各自检测通道的透镜(L)聚焦至用于信号采集的多模光纤(MMF)端口；此光纤端口内径即为共聚焦针孔；多模光纤的另一端连接单光子雪崩光电二级管(SPAD)， SPAD 将单光子信号转换成相应的电脉冲信号并传输至相关计算卡(correlation board). 相关计算卡的 FPGA 芯片以 90 ns的时间分辨率，对随时间波动的荧光信号进行相关计算(公式3、4a)并实时输出荧光自相关、交相关数据至计算机；计算机预装的数据采集软件控制仪器硬件并采集实验数据，数据分析软件对实验数据运用自相关、交相关数学模型进行定量分析从而得到受测分子的浓度、大小和味互作用等特性. Fig.4Schematic illustration of the bench-top fluorescence correlation spectrometer including the fluorescence excitationsystem， the sample handling system， the fluorescence detection system and the data acquisition/analysis system BC： Beam collimator； EmD： Emission dichroic mirror； EmF： Emission filter； ExD： Excitation dichroic mirror； FA： Optical fiber adaptor；L： Lens；MMF： Multi-mode optical fiber； S： Sample； SMF： Single-mode optical fiber； SPAD： Single-photon avalanche diode； WDM： Wavelength divisionmultiplexing. 硬件系统需解决的关键问题是如何调节荧光激发和检测光路，从而在溶液样品中精确、可重复地分离出一个极小的荧光激发和检测体积V(图2a，2b)，并且该体积内的激发光强度分布可近似用三维高斯 分布公式描述.因此，激发光需以平行光束入射并覆盖约80%显微镜后瞳I0.更重要的是，多模光纤端口内径(即共聚焦针孔)必须与透镜聚焦点处的荧光信号精确重合(图4)，以高效屏蔽荧光检测体积 V外的荧光信号(图2a，2b).光纤内径大小(50um)由显微镜物镜放大倍数和透镜焦距共同决定，其空间定位决定了 FCS 实验数据的准确性和可重复性.因此， CorTectorTM SX100 的每一荧光信号检测通道都配置3个伺服-步进电机，分别控制共聚集针孔在 x、y和z轴上的精确定位(约1p.m). 此外， CorTectorTM SX100 的样品台也由三个电机控制，可实现对多个溶液样品的自动定位.这些自动检测和定位系统大大减低 FCS 技术的使用难度，使非专业人员经简单培训即可操作仪器并实现批量样品的自动检测. 2.2 软件实现 样品的检测过程大致分为三步： a.使用HPLC 级纯净水作为样品(≥20u.l)检测仪器在当前工作环境下的背景噪声(散射光、探测器暗计数、Shot Noise、 After Pulse 等)； b.使用高光量子效率、不易猝灭、且已知浓度的标准荧光分子(Alexa488、Rhodamine Green)校验仪器光路并测定 荧光检测体积V(图2b)；c. 测测待检样品：每一样品的一次 FCS/FCCS 实验通常持续5~10s， 并重复10次.相关计算卡采集原始荧光信号，并根据实验要求进行自相关或交相关计算，计算结果实时输出至计算机，由数据分析软件做进一步分析. 为控制硬件设备完成上述检测，项目团队开发了便于操作的数据采集和数据分析软件.借助于数据采集软件(correlation acquisition)的操作界面，用户只需要简单操作就可以实现光路选择和数据采集等多个功能(图5a).根据实验设计，用户可选择启动488nm、638 nm激光器及相应的荧光探测光路；选择对1~8个溶液样品进行自动检测；驱动每一荧光探测通道的共聚焦针孔在 x/y/z 轴方向上的精确定位(约1um)(图5b).软件实时显示当共聚焦针孔处于搜索空间内不同位置时，仪器所检测到的荧光强度；待搜索完所有空间后，软件通过最小二乘法拟合获得荧光强度最优的位置(图5c). Fig.5 User interface example of the data acquisition software (Correlation Acquisition) 图6所示的是数据分析软件(correlationanalysis)的操作界面.用户需要选择待拟合的数据 和自相关/交相关拟合函数(图6a)；通常情况下，同一样品的检测要进行多次重复实验，因此软件需 要对相关计算卡所得的多组实验数据分别进行拟合(附录1，3)，并显示平均自相关衰减曲线和拟合误差(图6d)；若某组数据的拟合结果明显偏离拟合平均值，用户可以手动删除这组数据，然后软件会对剩余的实验数据进行重新拟合(图6b). 以自相关分析为例，拟合参数包括：N为待测样品荧光检测体积V内的平均受测分子个数， T为受测分子的特征扩散相关时间，S为荧光检测体积V的形状参数， T(0≤T<1)为检测体积V内受 激荧光分子处于三重态的比例，Tm为三重态寿命(即磷光寿命).如前所述，，正式的样品检测前，需要使用已知浓度的标准荧光分子溶液测定仪器在当前工作条件下的荧光检测体积V，然后根据检测体积V和待测样品的自相关幅度 G(0)值可得该样品浓度C(图6c)(附录1).同样的，通过荧光交相关分析可得荧光交相关幅度 Gx(0)、分子复合物M-M，的浓度C和和荧光检测体积V内分子复合物M-M，的平均个数(附录3). Fig.6 User interface example of the data analysis software (Correlation Analysis) (a) Selection of data and fitting model. (b) Analysis results. (c) Calibration. (d) Decay curve and residual distribution. 3桌面式荧光相关光谱仪的性能测试 3.1 样品制备 3.1.1 实验试剂 Alexa FluorM 647 (Life Technology，，A20186)：Alexa FluorM 488 TFP ester (Invitrogen， A37570)；经 Alexa488 标记的单克隆抗体(Alx488-mAb，donkeyanti-goat IgG， Invitrogen， A11055)；Alexa488标记的DNA单 链 (Alx488-ssDNA：Alx488-5'CCG CAC TAT ACG ATA GTA GTCATC AGC AGT CAG AGA CGG C3'：；1 umol/L)；Alexa647标记的 DNA单链(Alx647-ssDNA；Alx647-5'GCC GTC TCT GAC TGC TGA TGACTA CTA TCG TAT AGT GCG G 3'； 1 umol/L)： FITC(F7250， Sigma， USA)；抗 FITC 单克隆抗体(Abcam，UK)；荧光峰值为680 nm 的量子点(CdTe/CdS/ZnS Qdot680，北京北达聚邦科技有限公司)； Nuclease-Free Water(康维世纪)； AnnealingBuffer for DNA oligos (5X， Byotime，D0251)； HPLC级 Water(北京百灵威科技有限公司， CAS：7732-18-5)； EDTA-Naz·2H，0 (FLUKA 318892-500ML)；NaOH 颗粒(SIGMA 71687-500G)； Tris(Sigma 20160726)；硼酸(Acros 315181000)； 丙烯酰胺(华兴博创HX1869)； 过硫酸铵 (Sigma215589-100g)；TEMED (Amresco M146-100ML)；20 bp DNA Ladder Marker(Takara， Cat#3420A). 3.1.2 双链 DNA 复合及提纯 用生理盐水分别配制浓度为1nmol/L 的互补 Alx488-ssDNA 和 Alx647-ssDNA 溶液各 50 ul，放置4℃备用.将以上溶液混合摇匀并室温放置10 min， 然后依次在第15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80和100 min 对混合样品进行FCCS 检测. 配置单链 DNA 复合反应液： nuclease-freewater(24 pl)， annealing buffer for DNA oligos (5×，8 pl)， Alx488-ssDNA(1 umol/L， 4 pl)和 Alx647-ssDNA(1 umol/L， 4 p.l). 将上述反应液放置于PCR仪中，先设置95℃反应时间5 min， 然后设置72℃反应时间2min， 取出反应液后冷却至室温.用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化， 然后放置-20℃冰箱保存.实验时将 Alexa488 和Alexa647 荧光标记的 DNA 双链(Alx488-dsDNA-Alx647)溶液依次稀释5倍、10倍、20倍、50倍、100 倍、200倍、500倍、1000倍、5000倍、10000倍、20000倍和40000倍进行 FCCS 检测. 3.2 CorTectorM SX100 检测分子浓度、大小和相互作用 对配制浓度为1 nmol/L 的Alexa647(Alx647)荧光分子标准样品进行10 s， 每次10 s 的重复荧光自相关实验(图7a)；10次自相关衰减曲线几乎完全重叠，验证了仪器的稳定性.对平均自相关幅度(图7a；黑色数据点)进行最小二乘拟合，从拟合曲 线(图7a；红色曲线)的G(0)值可计算样品浓度为(0.70±0.03) nmol/L (standard error). 对3个数量级浓度区间(10 pmol/L~10 nmol/L)的 Alx647 样品进行测量，可得配制浓度与测得浓度之间的完美线性关系(线性回归系数R²=1；图8a). 在相同浓度(1nmol/L)条件下，应用荧光自相关技术对比不同分子质量的荧光待测物：荧光分子Alexa488(Alx488；分子质量约643 u)， 经Alx488标记的单链核酸片段(Alx488-ssDNA；40碱基，约13 ku)， 经Alx488 标记的单克隆抗体(Alx488-mAb，约15 ku)和荧光峰值为680 nm 的量子点(CdTe/CdS/ZnS Qdot680， 约15ku).受测物分子质量(体积)的增加反应在其自相关曲线的r，值增长(图7b). Tp值显示 Alx488 的水动力半径(Rn)远小于其他三种受测物. Alx488-ssDNA 与Alx488-mAb的分子质量相差不大，但前者为线性分子，后者更接近球形；因此两者在水溶液中因平移、翻滚运动而产生的水动力半径R，仍可通过自相关技术区分.厂家提供的 Qdot680 平均分子质量与 Alx488-mAb 相同，但我们的实验数据表明前者的RH 比后者显著的大.厂家提供的 Qdot680 的直径分布差异也很大(2~10 nm)；相应的自相关曲线的实验误差也很大.因此，荧光相关光谱技术可精确分析量子点体积及其分布，而量子点的大小是决定其光物理特性(比如荧光光谱)的关键因数之一.已有文献表明 FCS 技术还可用于测定量子点的关键光物理参数(光量子效率、化学修饰程度、光闪烁系数等)12-13] 筛选具高度特异性亲和力的单克隆抗体是科学研究和医疗检验的必要工作，而 FCS 技术可定量检测抗原-抗体结合反应的K，值.比如，荧光分子 FITC 的分子质量(约389u)远小于抗 FITC 单克隆抗体(mAb，约15ku)， 因此可以在均相溶液中应用荧光自相关技术直接检测游离态 FITC 和结合态 FITC-mAb的摩尔浓度.通过系统性地改变反应液中的 FITC/mAb 比例，并测定游离态和结合态的FITC 摩尔浓度，可得抗原-抗体结合曲线及其K，~7.7 nmol/L(图7c). Fig.8 Measurements of molecular concentrations in homogenous solution using the bench-topfluorescence correlation spectrometer (CorTectorM SX100) (a) FCS measurement of the molar concentrations of the fluorescent molecule Alx647. (b) FCS measurement of the molar concentrations of the Alx488labeled monoclonal antibody (Alx488-mAb).(C) FCS measurement of the molar concentrations of the Alx488 labeled single-stranded DNA(Alx488-ssDNA). (d) FCCS measurementnt of the molar concentrations of the Alx488 andAlx647labeleddouble-strandedDNA(Alx488-dsDNA-Alx647). 如果结合反应发生在大小相似的两种分子之间，比如两条互补单链 DNA 复合成一条双链DNA， 那么荧光交相关技术可用于测定该反应的反应速率和动力学常数K.例如，对两种互补的单链 DNA (Alx488-ssDNA 和 Alx647-ssDNA； 40碱基)室温条件下在生理盐水中复合，然后用 FCCS定时检测混合液的交相关幅度可得双链 DNA 产物的摩尔浓度变化(图7d中的插图).上述方法可监控 DNA 复合反应历程及其动力学参数K=1.2×10 (mol/L)-l·S-(图7d). 3.3CorTector'M SX100 的浓度检测线性区间 如前所述， FCS 技术可精确测量荧光分子溶液样品的浓度(图7a)；通过一系列浓度检测实验，我们确定了 CorTector'M SX100 的灵敏度下限及线性检测区间(图8a).各类医疗检测应用中，最常用的探针分子为经荧光标记的单克隆抗体或单链DNA片段.因此，我们测定了荧光自相关技术对Alx488-mAb 和 Alx488-ssDNA(40 碱基)探针分子的线性浓度检测区间.实验结果显示， FCS技术可在4个数量级的浓度区间内(10 pmol/L~100nmol/L)线性检测抗体和 DNA 探针分子的摩尔浓度(图 8b、8c).为了验证医疗检测试剂盒中最常用的“夹心法”(荧光免疫反应Ⅱ)，我们对图7d实验所得的双链 DNA(Alx488-dsDNA-Alx647)进行纯化，然后应用 FCCS 技术定量检测其摩尔浓度.实验 结果显示， FCCS 技术可对4个数量级浓度区间(17 pmol/L~143 nmol/L)的双链 DNA 样品进行精确测量，并且配制浓度与测得浓度之间呈完美的线性关系(R²=1.00；图8d). 以上结果表明，桌面式荧光相关光谱仪CorTectorM SX100 在检测分子浓度、分子体积和分子间相互作用等方面具良好性能，并在医疗体外检验领域有潜在的商业应用价值. 41讨 论 商业荧光相关光谱仪目前由国外高端显微镜厂商垄断，售价及维护费极高.表1列举了CorTectorTM SX100 与现有商业荧光相关光谱仪的性能和价格对比，可以发现前者具有很高的性价比.与德国 Zeiss 公司的 Confocor3 产品和美国ISSAlba 公司的 FCSV5 相比， CorTector'M SX100价格有巨大的竞争优势，能实现对溶液样品的常规荧光相关光谱技术.更重要的是， Confocor3 是显微镜实验室专用的大型光学设备.而CorTectorTMSX100 是桌面仪器，其光密设计能在室内、外光条件下应用于多种样品采集、制备场所.相应的，CorTectorTM SX100 后期使用、维护费也很低.更重要的是，CorTectorTM SX100 实现了 FCS 技术从实验室专业技术向大众技术的转变，在高性价比基础上保证了仪器可靠性和使用方便性，从而为该技 Table 1 Comparison of the performance-price characteristics of the commercial fluorescence correlation spectrometers Zeiss Confocor3(Germany) ISS Alba FCS V5(USA) LE CorTector-SX100(China) Microscope Confocal or multiphoton Confocal or multiphoton Confocal optical pathway Fluorescence excitation 3-5 lasers 2-6 lasers 2-4 lasers(488，638nm) Fluorescence detection 2-4 channels 2-4 channels 2-3 channels Microscope objective Zeiss 40X NA1.2 water Nikon 60XNA1.2 water Olympus 60X NA1.2 water Single-photon counting detector APD or GaAsP PMT APD or GaAsP PMT APD Automatic pinhole alignment XYZ-axes automatic Single-axis semi-automatic XYZ-axes automatic Sample option Solution， single cell (8-well Solution，single cell (8-well Solution (8-well chamber chamber optional) chamber optional) equipped) FCS， FCCS Analysis Yes Yes Yes RICS analysis Optional with laser scanning microscope Optional with laser scanning microscope M FLCS analysis Optional with multiphoton microscope Optional with multiphoton microscope PCH analysis Optional with software correlator Optional with software correlator Optional with software correlator Operation software Zen Vista vision Correlation Acquisition， Correlation Analysis Environment Microscope room Microscope room Regular lab bench-top Whole-system price 750-1.250k USD 250-500k USD 100-150k USD Maintenance Aannual cost~10% of sales price Annual cost~10% of sales price Annual cost ~5% of sales price 术在科学研究、医疗检测、环境检测、药物开发、传染病防治等领域的普及应用奠定了基础. ( 附件 附录1~附录3见本文网络版(http：//www. pibb.ac.cn) ) ( 参 考 文 献 ) ( [1 ] E lson E L ， M a gde D. Flu o rescence correlation spectroscopy .1. conceptual basis and theory. Biopolymers， 1974， 13 ( 1)： 1-27 ) ( [2] Magde D， E l son E L ， W e bb W W . Fluo r escence cor r elation spectroscopy . 2. e xperimental r e alization. Biopolymers， 1 9 74， 13(1)： 29-61 ) ( [3] 1 M agde D， E l son E ， Webb W W. The r modynamic fluctuations in a reactin g system - m e asuremen t by f l uorescence correlationspectroscopy. Phys Rev Lett， 1972，29(11)：705-708 ) ( E lson E L . F l uorescence correlation s p ectroscopy： p a st， p r esent， future. Biophys J， 2 0 11，101(12)：2855-2870 ) ( [5] 5 ] H ess S T， H u ang S， He ikal A A， et al. B i ological a nd chemicalapplications of fluorescence correlation spectroscopy： a review.Biochemistry， 2002， 41(3)：697-705 ) ( [6] Haustein E， S c hwille P. Fl u orescence correlation sp e ctroscopy： ) ( n ovel v ariations of an establishe d technique. 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P roc N atl Acad Sci USA， 2005，102(40)：14284-14289 ) CorTectorTM SX100：Principles and Applications ofa Bench-top Fluorescence Correlation Spectrometer WANG Zhu-Lou， KANG Ning， LIANG Yan-Qin，XIAO Qian*， HUANG Shao-Hui** (Key Laboratory of Interdisciplinary Research， Institute of Biophysics， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100101， China) Abstract Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) technologies have the advantage of ultrasensitivity (singlemolecule)， fast speed (seconds and minutes measurement time)， and multifunctionality (simultaneously analyzingmolecular concentration， size and interaction).Thus， FCS technologies have the potential of being a novelfluorescence immunoassay suitable for high-sensitivity analysis of homogeneous sample solution. This articleintroduces the principles and applications of FCS technologies based on the reliable， easy-to-use， bench-topfluorescence correlation spectrometer developed by the project team. Key words fluorescence correlation spectroscopy， fluorescence auto-correlation， fluorescence cross-correlation，single-molecule fluorescence DOI： 10.16476/j.pibb.2018.0058 ( * This work was supported by a grant from Guangdong Science and Technology Grant (20140215). ) ( **Corresponding author. ) ( HUANG Shao-Hui. Tel： 86-10-64887732， E-mail： shaohuih@ibp.ac.cn ) ( XIAO Qian. T e l ： 86-10-64888778， E-mail： qianxiao@moon.ibp.ac.cn ) 附 录 附录1荧光自相关衰减曲线的拟合方法 结合公式(2)和(3)可得相关时间r=0时的自相关幅度G(0)： 因此，实验测得的荧光信号波动幅度 G(0)值与荧光检测体积V内的平均受测分子个数和受测分子浓度C成反比.应用已知浓度C的标准荧光分子溶液样品，通过实验测得其 G(0)值(图2d)后，根据公式(s-1)可测定 FCS 仪器的荧光检测体积V(图2b).然后在当前状态下，对未知浓度的受测荧光分子样品测定其G(0)值，根据公式(s-1)可得该样品浓度 C. 如果溶液样品中存在一种自由扩散的荧光受测分子，并且荧光检测体积V内的激发光强度分布近似于三维高斯分布，就可以对实验所得自相关幅度 G(r)进行最小二乘法拟合B.7： 其中N=1/G(0)为荧光检测体积V内的平均受测分子个数，T，为受测分子的特征扩散相关时间，S为荧光检测体积V的形状参数(structure parameter)， T(0≤T<1)为检测体积V内受激荧光分子处于三重态(Triplet State)的比例， Tp为三重态寿命(即磷光寿命).T与激发光强度成正比；因此，在保证实验数据信噪比的前提下， FCS实验通常采用最小激发光强度使 T→0并由此最大限度地减少荧光分子猝灭. 拟合参数S描述的是荧光检测体积V的形状，由公式(s-3)确定： 荧光检测体积V中心处激发光的光强(I)最强； zo和r分别是沿Z或X(Y)轴，激发光强度减弱为Ie处离体积V中心的距离；e为自然常数.S的理论值为2~3，若FCS仪器的荧光激发和检测光路工作状态良好，S的实验测得值应小于10；另外，s值测量的可重复性反应了仪器工作状 对于理想的单分子荧光脉冲信号，拟合参数T，代表的是脉冲信号宽度(图2c)：即脉冲信号越宽，从G(0)=1衰减到G()=0所需的时间r，越长；而脉冲信号的宽度反应的是自由扩散的受测分子在荧光检测体积V内的停留时间；很显然，分子质量(体积)越大的受测分子扩散得越慢，在检测体积V内的停留时间也越长，因此相应的r，值就越大.同理，实验测得的T， 值(图2d)反应的是受测分子在溶液环境中的动态(翻滚、平移等)体积，并与其水动力半径R，(hydrodynamic radius)成正比(公式 s-5). 根据拟合参数N， T，和S值，，可进一步计算 FCS仪器和受测样品的属性B.7： 其中D为受测分子在溶液中的扩散系数(diffusioncoefficient； m²/s)， 由 Stokes-Einstein 方程式(公式s-5)决定：Kg为 Boltzmann 常数(J/K)、T为开尔文温度(K)、m为溶液的粘稠度(N·s/m²)、Rn为受检分子的水动力半径. CM为受测分子的摩尔浓度， N为阿伏伽德罗常数. 使用极低浓度样品时(比如10 pmol/L Alexa488)， FCS实验的背景信号(即 HPLC纯水样品信号)变得不可忽略并可能占样品信号的90%以上.但是，只要背景信号本身没有自相关性(即G(r)→0)则实验测得的样品浓度可由以下公式修正： 附录2荧光自相关技术定量分析分子-分子相互作用 如果溶液样品中存在i个自由扩散的荧光分子且相应的荧光亮度为y， 则实验测得自相关幅度可由以下公式拟合： =1 i=1 其中和G(r)分别为荧光分子的平均信号强度和自相关幅度. 因此，对于荧光免疫结合反应Ⅰ，假设游离态或结合态抗原并不影响其标记荧光分子的三重态光物理特性，其自相关幅度可用以下公式描述I5.8： 其中yp和yg分别是实验测得的游离态或结合态抗原标记荧光分子的亮度；N，和N，分别是游离态或结合态抗原分子在荧光检测体积V内的平均分子个数；Tm和 TBD分别是在抗体分子缺失或饱和的实验条件下，单独测定的游离态或结合态抗原分子的相关扩散时间.上述荧光免疫结合实验也可在足够低的激发光强度条件下进行，从而忽略标记荧光分子的光物理特性(即T→0). 附录3荧光交相关衰减曲线的拟合方法 按照以下公式对实验测得的荧光交相关幅度进行拟合[6，9]： TxD是分子M和M结合反应形成的分子复合物M-M2的相关扩散时间.其中： C、cz和Cy分别代表游离态M、游离态M和结合态M-M，分子浓度， Nx为分子复合物M-M，在荧光检测体积V内的平均分子个数.由于(C+Cx)和(Cz+Cx)分别代表了分子M和M在溶液样品中的总浓度(固定常数)，实验测得的荧光交相关幅度G(0)与分子复合物M-M，的浓度Cy成正比.此外，由公式(s-12)可得 Nx= Gx(0)/G(0)G(0)；因此对一次交相关实验所得的两条自相关衰减曲线和一条交相关衰减曲线进行分析可得荧光检测体积V内分子复合物M-M的平均个数. 对配制浓度为 1nmol/L 的 Alexa647(Alx647)荧 光分子标准样品进行 10s，每次10s的重复荧光自相关实验(图 7a)；10 次自相关衰减曲线几乎完全重叠，验证了仪器的稳定性．对平均自相关幅度 (图7a；黑色数据点)进行最小二乘拟合，从拟合曲线(图 7a；红色曲线)的 G(0)值可计算样品浓度为 (0.70依0.03)nmol/L(standarderror)．对 3 个数量级浓度区间(10pmol/L～10nmol/L)的 Alx647 样品进行测量，可得配制浓度与测得浓度之间的完美线性关系(线性回归系数 R2=1；图 8a)． 在相同浓度(1nmol/L)条件下，应用荧光自相关技术对比不同分子质量的荧光待测物：荧光分子 Alexa488(Alx488；分子质量约 643u)，经Alx488 标记的单链核酸片段(Alx488-ssDNA；40 碱基， 约 13ku)，经 Alx488 标记的单克隆抗体(Alx488mAb，约15ku)和荧光峰值为 680nm 的量子点 (CdTe/CdS/ZnSQdot680，约 15ku)。受测物分子质量(体积)的增加反应在其自相关曲线的tD值增长 (图 7b)．tD 值显示 Alx488 的水动力半径(RH)远小 于其他三种受测物．Alx488-ssDNA 与 Alx488-mAb 的分子质量相差不大，但前者为线性分子，后者更接近球形；因此两者在水溶液中因平移、翻滚运动 而产生的水动力半径 RH 仍可通过自相关技术区 分． 厂家 提供的 Qdot680 平 均分子质量与Alx488-mAb 相同，但我们的实验数据表明前者的 RH 比后者显著的大．厂家提供的 Qdot680 的直径 分布差异也很大(2～10nm)；相应的自相关曲线的实验误差也很大．因此，荧光相关光谱技术可精确 分析量子点体积及其分布，而量子点的大小是决定 其光物理特性(比如荧光光谱)的关键因数之一．已 有文献表明 FCS 技术还可用于测定量子点的关键 光物理参数(光量子效率、化学修饰程度、光闪烁系数等)。