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HRM中基因分型检测产品配置单(基因扩增仪)

  • 应用领域: 生物产业
  • 检测样品: HRM
  • 检测项目:基因分型
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  • 发布时间:2019-05-05
  • 参考标准:基因分型
HRM实现基因分型 作者:福生生物 基因分型在动物、植物、微生物的物种、菌种筛查、筛选、缺陷、突变基因的检测,根据个体基因类型实现对诸如癌症治疗、监测等的精准用药,以及消费类基因检测如酒精代谢能力基因检测等等领域有很多应用。 通常,基因分型SNP采用荧光探针终点法,检测一个位点需要两个荧光探针,如一个探针的荧光报告基团用FAM通道,另一个用HEX(VIC)通道来检测。由于合成PCR荧光探针的成本较高,为降低成本,可以采用较小的反应体系,如在384孔荧光定量PCR仪上使用5uL的反应体系。对于一些非临床及消费类、或者需要检测几十个位点以上、对成本敏感的基因分型检测应用项目,可以考虑使用饱和染料的高分辨熔解曲线法HRM(High Resolution Melting Curve分辨率优于0.1°C),如果不包括核酸提取的费用,与探针法比,成本可降低10倍,甚至100倍。 HRM法为了能够在熔化温度Tm上区分出只差一个碱基的两个DNA片段,在保证特异性的前提下,选择被扩增的DNA片段的长度越短越好,因此,除了引物的设计有扩增片段短的特殊要求外,对荧光定量PCR仪的HRM性能及扩增的准确性能则有很高的要求。以下几点是保证HRM实现正确、可靠的基因分型的关键。 首先,HRM的分辨率最好优于0.05°C,一般,只有采用荧光成像技术的QPCR仪,因为同时采集所有样品孔的信号才能胜任,而采用扫描技术的仪器完成一次全板扫描一般需要5秒以上,也就是说第一个孔和最后一个孔的检测时间差为5秒以上,熔化过程中温度是连续变化的,这将导致每次检测各孔上的温度的不一致,因此,扫描式的QPCR仪一般不适合做HRM。 第二,为了用只生成小于100bp扩增产物的引物,有时可能无法很好地兼顾特异性,又由于HRM染料法本身特异性就较弱,这就给荧光定量PCR实验带来易发生非特异性的压力,除了需要选用扩增特异性好的QPCR Master Mix外,还需要先用梯度QPCR预实验来优化退火温度,找到该引物的最佳退火温度后,再使用Touchdown PCR 或称TD PCR来有效地控制非特异性扩增。Stepdown PCR也能够抑制非特异性扩增,但抑制效果较Touchdown PCR弱一些。 第三, 如果需要区分两个纯合子的Tm差较小时,例如当两个纯合子的Tm差只有0.5°C时,它们对应的杂合子就可能难以单纯依靠Tm与两个纯合子区分开来,这时,我们可以引入熔解曲线的Tm峰宽因子或峰的线型来判断杂合子。   图一为在福生生物的FS384 QPCR仪上使用5uL反应体系的FAM和VIC两种探针的终点法检测一个位点的384个样品的SNP分型结果。   图二为在福生生物的FS384 QPCR仪上用Touchdown PCR方法来扩增,接着用高分辨率0.02°C 的HRM实现低成本的基因分型,图中左下角的表列出了所有样品孔,根据Tm值及其峰宽值正确判断出每个样品的分型结果。在这个实验中,两个纯合子的峰宽都小于1.5°C,而杂合子的峰宽在2°C左右。
  • 配置
  • 品牌型号
  • 参考报价
  • 所需试剂
  • 8888RMB

HRM实现基因分型

作者:福生生物

 

基因分型在动物、植物、微生物的物种、菌种筛查、筛选、缺陷、突变基因的检测,根据个体基因类型实现对诸如癌症治疗、监测等的精准用药,以及消费类基因检测如酒精代谢能力基因检测等等领域有很多应用。

通常,基因分型SNP采用荧光探针终点法,检测一个位点需要两个荧光探针,如一个探针的荧光报告基团用FAM通道,另一个用HEX(VIC)通道来检测。由于合成PCR荧光探针的成本较高,为降低成本,可以采用较小的反应体系,如在384孔荧光定量PCR仪上使用5uL的反应体系。对于一些非临床及消费类、或者需要检测几十个位点以上、对成本敏感的基因分型检测应用项目,可以考虑使用饱和染料的高分辨熔解曲线法HRM(High Resolution Melting Curve分辨率优于0.1°C),如果不包括核酸提取的费用,与探针法比,成本可降低10倍,甚至100倍。 HRM法为了能够在熔化温度Tm上区分出只差一个碱基的两个DNA片段,在保证特异性的前提下,选择被扩增的DNA片段的长度越短越好,因此,除了引物的设计有扩增片段短的特殊要求外,对荧光定量PCR仪的HRM性能及扩增的准确性能则有很高的要求。以下几点是保证HRM实现正确、可靠的基因分型的关键。

首先,HRM的分辨率最好优于0.05°C,一般,只有采用荧光成像技术的QPCR仪,因为同时采集所有样品孔的信号才能胜任,而采用扫描技术的仪器完成一次全板扫描一般需要5秒以上,也就是说第一个孔和最后一个孔的检测时间差为5秒以上,熔化过程中温度是连续变化的,这将导致每次检测各孔上的温度的不一致,因此,扫描式的QPCR仪一般不适合做HRM。

第二,为了用只生成小于100bp扩增产物的引物,有时可能无法很好地兼顾特异性,又由于HRM染料法本身特异性就较弱,这就给荧光定量PCR实验带来易发生非特异性的压力,除了需要选用扩增特异性好的QPCR Master Mix外,还需要先用梯度QPCR预实验来优化退火温度,找到该引物的最佳退火温度后,再使用Touchdown PCR 或称TD PCR来有效地控制非特异性扩增。Stepdown PCR也能够抑制非特异性扩增,但抑制效果较Touchdown PCR弱一些。

第三, 如果需要区分两个纯合子的Tm差较小时,例如当两个纯合子的Tm差只有0.5°C时,它们对应的杂合子就可能难以单纯依靠Tm与两个纯合子区分开来,这时,我们可以引入熔解曲线的Tm峰宽因子或峰的线型来判断杂合子。

  图一为在福生生物的FS384 QPCR仪上使用5uL反应体系的FAM和VIC两种探针的终点法检测一个位点的384个样品的SNP分型结果。

 

图片1.png

图二为在福生生物的FS384 QPCR仪上用Touchdown PCR方法来扩增,接着用高分辨率0.02°C 的HRM实现低成本的基因分型,图中左下角的表列出了所有样品孔,根据Tm值及其峰宽值正确判断出每个样品的分型结果。在这个实验中,两个纯合子的峰宽都小于1.5°C,而杂合子的峰宽在2°C左右。

 

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