找靠谱仪器,就上仪器信息网~

新鲜牡蛎中碱性磷酸酶的分离提取及比活力检测产品配置单(氮吹仪)

  • 应用领域: 食品/饮料
  • 检测样品: 水产及制品
  • 检测项目:理化分析
  • 浏览次数:40 次
  • 下载次数:2 次
  • 发布时间:2018-12-27
  • 参考标准:企业
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。
  • 配置
  • 品牌型号
  • 参考报价

004 148自动水浴氮吹仪正面图.jpg

一、实验原理

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase EC 3.1.3.1简称为ALPase)广泛存于微生物界和动物界。ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应,产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应,磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。在磷的生物和化学循环过程中,ALPase起了及其重要的作用。在生物体内ALPase与磷的代谢直接相关,参与磷与钙物质的消化、吸收、分泌以及骨骼的形成等生理生化过程。ALPase的作用最适PH在碱性区域,一般在PH9.0~10.5范围内。Mg2+对该酶的活力有显著的激活使用。

为了获得好的提取效果,在酶的制备过程,特别应注意以下几点:

(1)选取来源丰富、酶含量高的新鲜材料。提取工作应在获得材料后立刻开始,否则应在低温下保存。

(2)用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。碳酸铵是最常用的盐。操作时,要注意保持缓冲液的合适PH值和温度。在加碳酸铵时需事先将其研细,需缓慢加入并及时搅拌溶解,尽量防止泡沫形成,以免酶蛋白在溶液中表面变性。盐析生成的沉淀,要静置20min以上,以使沉淀完全,然后方可时行离心分离。

(3)有机溶剂沉淀法也常用于蛋白质的分离提纯。丙酮和乙醇是使用最为广泛的两种有机溶剂。应注意在低温下操作,缓慢加入,充分搅拌,避免局部浓度过高放出大量热量而使酶蛋白变性。离心收集沉淀后,最好立即将其溶于适量缓冲液中,以避免酶活力的丧失。

(4)在酶的制备过程中,每经一步处理,都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大,提纯步聚才有效。

     酶活力的分析:通常是以对—硝基苯磷酸二纳(pNPP)为底物,在PH10.1的碳酸盐缓冲液(含2mmol/L Mg2+)的测活体系中检测酶催化pNPP水解产生黄色的对硝基苯( pNP)在405 nm处有最大的吸收峰,可以根据OD4〇5值的增加计算酶活力的大小。酶活力定义为在37℃下,以5mmol/L pNPP为底物,在pH 10.1的碳酸盐缓冲液含2 mmol/L  Mg2+的测活体系中每分钟催化产生1 mol/L pNP的酶量定为1个酶活力单位。酶的比活力定义为每mg蛋白所具有的酶活力单位数。

蛋白质浓度的测定常采用福林-酚试剂(Folin-Phenolreagem)显色法,详见北京来亨科贸有限责任公司技术文章。

 

二、实验用品

(一)器材

    (1) 髙速组织捣粹机和玻璃匀浆器。

    (2) 离心机。

    (3) 超级恒温水浴锅。

    (4) 酸度计。

    (5) 722分光光度计。

    (6)天平、台秤。

    (7)透析袋。

    (8)磁力搅拌器。

    (9)冰箱。

    (10)秒表。

    (11)50?L微量进样器。

(二)试剂

     (1)含0.1mol/L NaCl 的0.01mol/L Tris.HCL PH7.5缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷1.214g,NaCl5.8g,溶于蒸馏水中,加入80ml 0.1mol/L HCL,用蒸馏水定容到1000ml。

     (2)正丁醇(分析纯)。

     (3) 硫酸铵(分析纯)。

     (4) 0.5% NaCl:称取 5 g NaCl 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (5) 0.1 mol/L Na2C〇3-NaHC〇3  pH 10.1 缓冲液:分别取(A)液 70mL,(B)液30ml混匀,用酸度计准确调节pH 10.1。

         (A) 0.1 mol/L Na2C〇3溶液:取 28.6 g Na2C〇3.10H20溶于1000 mL蒸馏水中 。    

         (B) 0.1 mol/L NaHC〇3 溶液:取 8.4 g NaHC〇3 溶于1000 mL蒸馏水中。

     (6) 0.5 mol/L醋酸镁溶液:称取醋酸镁107.25 g溶于蒸馏水中,稀释成1000ml。

     (7) 0.1 mol/L醋酸钠溶液:称取醋酸钠8.2 g溶于蒸馏水中,稀释至1000 ml。

     (8) 0.01 mol/L醋酸镁-0.01 mol/L醋酸钠溶液:取0.5 mol/L醋酸镁20ml醋酸钠100 mL,混匀后加蒸馏水稀释至1000 mL。

    (9) PH8.8 Tris.HCl缓冲液:称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.1 g,用蒸馏水溶解。并稀释至1000ml,即为0.1 mol/L Tris溶液。取0.1 mol/L Tris 溶液100mL,加蒸馏水约800ml,再加0.1 mol/L醋酸镁100 mL,混勻后用1 %醋酸调节pH至8.8,用蒸馏水稀释至1000ml即可。

    (10) 丙酮(分析纯)。

    (11) 95%乙醇(分析纯)。

    (12) 20 mmol/L Mgcl2:称取 1.904 g Mgcl2溶于1000ml蒸馏水中。

    (13) 0.1 mol/L NaOH:称取 4 g NaOH 溶于1000ml蒸馏水中。

    (14)  20 mmol/L 对硝基苯磷酸二钠(pNPP):称取371.2 mg pNPP溶于50ml蒸馏水中。

    (15) 底物溶液(5mmol/L pNPP):按以下比例混句(5):(6):(8):H2O=l:0.2:0.50:.28。

    (16)0.5?mol/mL对硝基苯酚(pNP=141.1)溶液:精确称取17.64mg对硝基苯酚,用蒸馏水溶解并定容至250 mL。



  • 点赞 ()

  • 收藏

  • 分享

  • 下载

贡献者的其他方案
方案贡献者

北京来亨科贸有限责任公司

仪信通银牌会员

解决方案总数:0

方案浏览总量: 0

按类找方案