雌酮中定量分析检测方案(液相色谱仪)

thermoscientific热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com 全新一代三重四极杆液质联用仪 TSQ Altis在激素类化合物定量分析中的应用 张婷岚吕辰彭蜀莹唐恺徐牛生 摘要 本文在赛默飞全新液相色谱串联质谱的三重四极杆平台TSQ Altis 上建立了快速液质检测方法，同时测定临床研究中常见的9种激素类化合物，其中包含4种皮质激素、3种雌激素、1种孕激素及1种雄激素。本文中涉及的9种激素类化合物在其相应的浓度范围内线性关系良好(r>0.99)，LOD 及 LOQ均能满足临床研究对于激素类化合物的检测要求，准确度与精密度结果显示该方法精密度相对标准偏差RSD ≤ 7.72。因此，本方法对激素类化合物的临床研究具有指导和参考意义。 关键词 激素， TSQ Altis， 液相色谱串联质谱，临床 1、引言 类固醇激素是一类结构上具有环戊烷多氢菲结构的脂溶性激素，，己可以分为皮质激素和性激素。皮质激素包括盐皮质激素和糖皮质激素，具有调节糖代谢、水盐代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢的生理作用。性激素是由性腺分泌的一类甾体激素，受下丘脑-垂体前叶-性腺轴的调控，包括雌激素、孕激素和雄激素。 激素类化合物由于在血液中含量低且结构类似物众多，因此对方法的灵敏度和特异性要求很高。目前，激素定量分析方法包括免疫测定法、气相色谱质谱联用法和液相色谱质谱联用法等。免疫测定方法虽然通量高，但是存在专属性差：准确度低的缺点；气相质谱联用方法虽然选择性好和灵敏度高，但是由于激素的低挥发性，需要经过复杂的衍生化反应，不适宜高通量生物样品分析；而液相色谱质谱法专属、灵敏，可以实现快速高样品通量分析，现已成为激素类化合物生物样品定量分析的首选方法。 作为由内分泌细胞分泌的内源性生物活性物质，激素在体内通过调节各种组织细胞的代谢从而影响人体的生理活动，其指标含量对人体健康有重要诊断依据，缺乏或过量都会引发各种疾病。本文针对9种激素类化合物在全新的 TSQ Altis三重四极杆液质联用平台上建立了一种灵敏度高、专属性强的定量检测方法。 2.1仪器与试剂 2.2化合物信息及溶液配制 Thermo Fisher Vanquish Binary Flex 超高效液相色谱仪Thermo Fisher TSQ Altis 三重四极杆质谱仪甲醇(色谱纯，美国 Thermo Fisher公司)；实验用水为Milli-Q去离子水； NHOH(色谱纯， SIGMA) 2.2.19种激素类化合物信息(表1) 表1.9种化合物信息 Table 1 Information of 9 compounds 类别 序号 简写 英文名 中文名 CAS 化学式 分子量 皮质激素 1 CORT Corticosterone 皮质酮 50-22-6 C21H30O4 346.46 2 COR Cortisone 可的松 53-06-5 C21H28O5 360.44 3 F Cortisol 氢化可的松/皮质醇 50-23-7 C21H3005 362.46 4 ALD Aldosterone 醛固酮 52-39-1 C21H2805 360.44 孕激素 5 P Progesterone 孕酮 57-83-0 C21H30O2 314.46 雄激素 6 A2 Androstenedione 雄烯二酮 63-05-8 C19H26O2 286.41 7 E1 Estrone 雌酮 53-16-7 C18H22O2 270.37 雌激素 8 E2 Estradiol 雌二醇 50-28-2 C18H24O2 272.38 9 E3 Estriol 雌三醇 50-27-1 C18H24O3 288.38 Table 2 Gradient Elution Program 时间 A% B% 流速 (min) (含0.05%NH4OH的水) (甲醇) (mL/min) 0.00 85 15 0.3 1.00 85 15 0.3 1.50 60 40 0.3 2.00 20 80 0.3 4.00 10 90 0.3 5.00 10 90 0.3 5.50 85 15 0.3 7.00 85 15 0.3 2.4质谱条件 可加热电喷雾电离源(HESI)，正、负离子切换扫描模式；扫描方式 SRM；喷雾电压(+/-)3500/3200V；离子传输管温度350℃；鞘气压力 25 arb；辅助气压力8 arb；离子源 温度380℃；碰撞气压力2mTorr；选择反应监测离子对信息见表3； 表3.9种化合物及质谱采集参数 Table 3 MS/MS parameters of 9 compounds and Internal Standard 化合物 电离模式 母离子 RF Lens 电压 子离子 碰撞能量 (m/z) (m/z) ( 皮质酮 ESI(+) 347.16 55 293.15* 16 皮质酮 ESI(+) 347.16 55 311.17 16 皮质酮-D8 ESI(+) 355.16 55 337.23 16 可的松 ESI(+) 361.11 63 121* 30 可的松 ESI(+) 361.11 63 163.08 23 可的松-D7 ESI(+) 368.15 63 168.14 24 氢化可的松 ESI(+) 363.11 57 121 25 氢化可的松 ESI(+) 363.11 57 309.17* 17 氢化可的松-D4 ESI(+) 367.16 57 331.16 16 醛固酮 ESI(-) 359.11 58 331.14 15 醛固酮 ESI(-) 359.11 58 189.17* 17 醛固酮-D7 ESI(-) 366.16 62 338.17 15 孕酮 ESI(+) 315.16 53 97.05 22 孕酮 ESI(+) 315.16 53 109.07* 25 孕酮-C3 ESI(+) 318.15 54 112.05 25 雄烯二酮 ESI(+) 287.11 51 109.05 24 雄烯二酮 ESI(+) 287.11 51 97.05* 21 雄烯二酮-C3 ESI(+) 290.11 56 100.00 22 雌酮 ESI(-) 269.06 91 145* 37 雌酮 ESI(-) 269.06 91 182.98 37 雌酮-D4 ESI(-) 273.06 95 147.00 38 雌二醇 ESI(-) 271.04 91 183.04* 41 雌二醇 ESI(-) 271.04 91 145 37 雌二醇-D3 ESI(-) 274.05 95 185.10 42 雌三醇 ESI(-) 287.07 96 145.03* 42 雌三醇 ESI(-) 287.07 96 183.04 42 雌三醇-D3 ESI(-) 290.06 96 173.07 43 注：带*的为定量子离子 3、实验结果与讨论 3.1专属性 采用上述仪器分析方法，9种激素类化合物及其内标物在7分钟内均可获得良好的色谱峰，图1为9种激素类化合物 在1 ng/mL浓度下的选择离子流提取图，各化合物保留时间见图示。 图1.9种化合物及其内标物的色谱图 Fig.1 EIC Chromatogram of 9 Compounds and Internal Standards 3.2线性范围及灵敏度测试 采用上述仪器分析方法，对9种激素类化合物进行线性范围 结果显示线性关系良好。9种激素类化合物线性方程及线性测试，采用加权(1/x)计算线性相关系数r均大于等于0.999， 相关系数结果见表4。 表4.9种化合物的线性范围、线性方程及相关系数 Table 4 Linear Ranges， Linear equations and correlation coefficients of 9 compounds 化合物 线性范围 线性方程 相关系数 LOQ (ng/mL) (r) (pg/mL) 皮质酮 (ng/mL) y=2776.54+137358x 0.9995 10 可的松 0.01-20 y=3680.3+379327x 0.9996 10 氢化可的松 0.01-20 v=1002.68+103718x 0.9994 10 醛固酮 0.05-20 y=57.3627+9887.38x 0.9999 50 孕酮 0.005-20 v=1761.03+622511x 0.9997 5 雄烯二酮 0.005-20 y=6295.64+1307790x 0.9991 5 雌酮 0.01-20 y=27.2107+25733.1x 1.0000 10 雌二醇 0.05-20 v=55.1613+7025.29x 0.9998 50 雌三醇 0.01-10 y=54.3333+76107.4x 0.9998 10 表5.9种化合物的精密度测试数据(n=6) Table 5 Precision for the determination of 9 compounds (n=6) 峰面积 皮质酮 可的松 氢化可的松 醛固酮 孕酮 雄烯二酮 雌酮 雌二醇 雌三醇 序号 1 8722 21489 5373 4560 30861 16908 1348 793 4172 2 8931 22107 6271 4629 32497 15310 1205 694 3835 3 9965 20942 6181 4612 32247 15394 1366 757 3691 4 8669 20100 5642 4349 29068 17942 1429 799 3682 5 9228 20940 6107 4473 32955 16569 1422 737 3532 6 8391 21921 5628 4997 31731 18481 1423 734 4116 Average 8984.3 21249.8 5867.0 4603.3 31559.8 16767.3 1365.5 752.3 3838.0 SD 555.7 742.3 366.4 218.8 1415.9 1295.0 85.6 39.6 256.3 RSD 6.2% 3.5% 6.2% 4.8% 4.5% 7.7% 6.3% 5.3% 6.7% 本文在赛默飞全新三重四极杆液质联用仪TSQ Altis 平台上建立了同时定量检测9种激素类化合物的液质联用方法。由实验结果可以看出，该检测方法不仅具有优异的专属性、 本文在赛默飞全新液相色谱串联质谱的三重四极杆平台TSQ Altis 上建立了快速液质检测方法，同时测定临床研究中常见的 9 种激素类化合物，其中包含 4 种皮质激素、3 种雌激素、1 种孕激素及 1 种雄激素。本文中涉及的 9 种激素类化合物在其相应的浓度范围内线性关系良好（r2>0.99），LOD 及 LOQ 均能满足临床研究对于激素类化合物的检测要求，准确度与精密度结果显示该方法精密度相对标准偏差RSD ≤ 7.72。因此，本方法对激素类化合物的临床研究具有指导和参考意义。类固醇激素是一类结构上具有环戊烷多氢菲结构的脂溶性激素，可以分为皮质激素和性激素。皮质激素包括盐皮质激素和糖皮质激素，具有调节糖代谢、水盐代谢、脂肪代谢、蛋白质代谢的生理作用。性激素是由性腺分泌的一类甾体激素，受下丘脑 - 垂体前叶 - 性腺轴的调控，包括雌激素、孕激素和雄激素。赛默飞全新三重四极杆液质联用仪 TSQ Altis 平台上建立了同时定量检测 9 种激素类化合物的液质联用方法。由实验结果可以看出，该检测方法不仅具有优异的专属性、灵敏度和线性范围，而且通过对日内精密度的测试也反映了仪器及方法的稳定性良好，使用本方法进行激素类化合物的分析可以保证数据的可靠性。