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水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等中植物DNA检测产品配置单(水浴、油浴)

  • 应用领域: 农/林/牧/渔
  • 检测样品: 粮食及经济作物
  • 检测项目:植物遗传
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  • 发布时间:2018-11-06
  • 参考标准:企业
植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同,为获得高相对分子质量DNA,应取幼嫩组织或组织培养物为材料,常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。 由于植物材料DNase水平低,蛋白含量较少,其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。
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004 148自动金属浴氮吹仪正面图.jpg 

一、实验原理

植物DNA的制备与动物DNA制备原理大致相同,为获得高相对分子质量DNA,应取幼嫩组织或组织培养物为材料,常以液氮冷冻下研磨的方法破组织和细胞。

 

由于植物材料DNase水平低,蛋白含量较少,其操作要求是要克服植物次生代谢物如多酚、类黄酮和植物多糖与DNA共存对制备的影响。

 

二、实验用品

  (一)器材

1)冰冻高速离心机。

2)液氮罐。

3)台式离心机。

4)电热恒温水浴锅。

5)电热恒温培养箱。

6)电冰箱,离心管和tip。

(二)试剂  

1)5mol/L Nacl:称取NaCL 146.10g用蒸馏水定容至500ml。

(2)CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)缓冲液

      A.2mol/L Tris.HCL缓冲液(pH8.0):24.2g Tris溶于80ml重蒸水中,用浓盐酸调节pH至8.0,用重蒸水定容至100ml。

      B.0.5mol/L EDTA缓冲液(PH8.0):取186.12g EDTA.Na2用重蒸水800ml溶解,然后用NaOH调节pH至8.0,加重蒸水至1000ml。

3)巯基乙醇。

4)PVP(聚乙稀吡咯烷酮)。

5)石英砂。

6)氯仿:异戊醇(24:1),现用现配。

(7)异丙醇

(8)75%乙醇。

(9)TE缓冲液:取5ml 2mol/L Tris-HCL2ml0.5mol/L EDT.Na2。用重蒸水定容至1000ml

(10)RNase A:取100mg RNase溶于10ml含有10mmol/L Tris(pH7.5)-15mmol/L Nacl 的溶液中,于100加热15min,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20

 

(三)材料

    水稻幼苗或蚕豆幼苗和白菜嫩叶等。

 

二、实验程序

(一)操作方法

 1.操作步聚

 1)在50ml离心管中加入10ml CTAB缓冲液。

 2)取1~2g新鲜叶片(去主脉)于研钵中,加入0.1gPVP或石英砂,在液氮中迅速研磨成粉末后,把粉末转入带CTAB缓冲液的离心管中,边加边搅拌使之混合均匀。

3)于65水浴保温0.5~1h

4)冷却至室温后,加入等体积10mlTrichloromethane异戊醇溶液,颠倒混匀10min

510000 r/min离心10min,去沉淀,将上清液转入另一离心管中。

6)在上清液中加入1/10体积的3mol/L醋酸钠和1倍体积的异丙醇 10ml2倍体积乙醇,轻缓颠倒混合均匀,于-20放置30min

710000 r/min 4离心10min,去上清液。

8)用2ml75%乙醇洗涤2次去除盐(可放置-20冰箱过液)。

9)倒去75%乙醇,37℃干燥20分钟,再溶于600?L TE缓冲液中,转移至1.5ml EP管

(10)加入3?L RNase A ,37℃保温30min。

11)用等体积Trichloromethane异戊醇溶液抽提1~3次。

12)10000r/min,4℃离心10min,吸取上清。

(13)上清液加入1/10体积4mol/L NaCL溶液后,加入2倍体积无水乙醇,放置20min后,10000r/min,离心5min沉淀DNA。

(14)沉淀用75%乙醇乙洗涤2~3次,37℃保温箱中干燥后溶于适量的TE缓冲液中备用。

 

2得率的计算

由于1OD260DNA浓度为50?g/ml,因此DNA得率可按下公式计算:

1g新鲜组织的DNA含量=OD260×50×溶解体积/组织鲜重(?g DNA/g)。


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