新鲜兔肝或鸡肝中DNA的制备提取检测产品配置单(水浴、油浴)

  • 应用领域: 食品/饮料
  • 检测样品: 肉制品
  • 检测项目:理化分析
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  • 发布时间:2018-11-06
  • 参考标准:企业
提取核酸的基本程序包括细胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白质-沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多,高等动植物材料常用液氮研磨法。 核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl盐溶液的溶解度很低的特点而实验其与RNA核蛋白分离,残存的RNA经 R Nase水解而去除。 蛋白质经蛋白酶水解,并经苯酚、Trichloromethane变性而分开。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集,最终实现DNA分离纯化之目的。
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148左倾加热图400.jpg 

一、实验原理

提取核酸的基本程序包括细胞破碎-解聚核蛋白并去除蛋白质-沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多,高等动植物材料常用液氮研磨法。

 

核蛋白利用DNA核蛋白在0.14mol/L Nacl盐溶液的溶解度很低的特点而实验其与RNA核蛋白分离,残存的RNA经 R Nase水解而去除。

 

蛋白质经蛋白酶水解,并经苯酚、Trichloromethane变性而分开。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集,最终实现DNA分离纯化之目的。

 

二、实验用品

  (一)器材

1)离心机。

2)水浴锅。

3)紫外分光光度计。

4)研钵、液氮、带盖离心管。

(二)试剂  

1)蛋白酶K:用水或TEN9溶液溶解成10mg/ml,或直接用粉末。

2)TEN9 pH9.0:称取Tris6.05g EDTA.Na237.224g和NaCL 11.688g按顺序溶于蒸馏水中,以HCL调PH9.0。

3)TE溶液:50mmol/L Tris.HCL(PH8.0)-10mmol/L EDTA.Na2(PH8.0)

4)SS-phenol:以Tris平衡重蒸酚至PH8.0,加入0.1%的8-羟基喹啉(使溶液呈黄色,防止酚的氧化)。

5)1mmol/L Tris.HCL(PH8.0):Tris121.14g溶解于蒸馏水中,以HCL调PH至8.0定容至1L。

6)20% SDS:20g SDS溶于100ml蒸馏水中,配制时要小心,SDS对呼吸道有强烈的刺激,且毒性较大。

(7)RNase A 若试剂含有痕量DNase,用前100 10min灭活DNase

(8)3mol/L NaAc,pH6.5:称取NaAc.3H2O408.1g溶于蒸馏水中,HAcPH6.5后定容至1L

   TEN9、 Tris.HCL、NaAc均需高压灭菌。

 

(三)材料

    新鲜兔肝或鸡肝。

 

二、实验程序

(一)操作方法

 1.操作步聚

 1)在液氮存在的条件下,于研中将5g动物组织碾成细粉(约需20~30min)。

 2)待液氮挥发后,将细粉转至50ml带盖的离心管中,加入20mlTEN9和RNase(100?g/ml),混合均匀,加入1ml 20%SDS,将离心管上下颠倒几次,并继续轻揺10min。

3)加入10mg蛋白酶K粉末,慢速搅拌使之溶解并混匀。

4)在3755 保温2~4小时,其间不时地轻摇。

5)如需要,再加入10mg蛋白酶K粉末,继续保温至少2h,使组织充分消解。

6)加入20ml SS-phenol,温和颠倒离心管,使两相充分混合,形成类似乳浊液状。

7)室温,10000r/min离心10min,使混合液清晰分相(如分层不明显,可适当加大离心力及离心时间)。上层水相含DNA,中间为变性蛋白质,下层为酚相。

8)用大口吸管将上层水相转至另一只离心管中,弃去界面相和酚相。

9)将第6~8步重复进行几次,直至中间相完全消失(蛋白质必须去除干净,否则对DNA的溶解及酚切都不利)。

(10)离心后,将水相转到透析袋中以去除小分子物质。在TE中透析(稀释因数应大于1000,稀释因数指外界溶解与待透析液体积比的累积乘积),并用磁力搅拌器搅拌,提高透析效率,2h后转至4继续透析4h或过液(开始时,溶液中含大量的SDS,低温下易析出,因此开始时必须先在温室透析,由于透析袋较昂贵,用后可用TE浸泡,煮沸10min,可续用),可静止透析。

11)将透析后的溶液转至50ml离心管中,加入NaAc溶液,使其终浓度为0.3mol/L,再加入0.8体积的异丙醇,温和混匀(亦可用2倍体积的乙醇代替异丙醇,但可能使沉淀体积过大)。

12)用玻璃棒绕起或钩出呈现纤维状的DNA,由于异丙醇不易干燥,可用70%的乙醇快速冲洗干燥后,在2~5ml TE中完全溶解,并置冰箱保存。

13)测定此DNA溶液在260nm和280nm波长下的OD值,此值应大于1.7.如果小于1.7,则说明含较多的蛋白,需加少量蛋白酶K保温后,用SS-酚进一步抽提。另外,235nm处为盐类及小分子化合物的吸收峰,因此应大于1.7。

 

2得率的计算

由于1OD260DNA浓度为50?g/ml,因此DNA得率可按下公式计算:

1g新鲜组织的DNA含量=OD260×50×溶解体积/组织鲜重(?g DNA/g)。


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