人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)检测试剂盒

人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)检测试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围： 规格：96T/48T 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)含量。 实 验 原 理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)水平。用纯化的抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)抗原、生物素化的人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人1,25二羟基维生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)呈正相关。 使用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1瓶 2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品 0.5ml×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个 标本要求 血清： 室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 血浆： 应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成应再次离心。 尿液： 用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。 4.细胞培养上清： 检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。 5.培养细胞: 检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 6.组织标本: 切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 7.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 8.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 操作步骤 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 2000pg/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 1000pg/ml 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 500pg/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 250pg/ml 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 125pg/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。 操作程序总结： 计算 以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 注意事项 1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6．底物请避光保存。 7．严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8．所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 9．本试剂不同批号组分不得混用。 保存条件及有效期 1．试剂盒保存：；2-8℃。 2．有效期：6个月