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DNA测序仪/基因测序仪百科

DNA测序仪/基因测序仪
DNA测序仪/基因测序仪 第一代基因测序仪 第一代测序技术即Sanger链终止法为原理的测序技术。 一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火,然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链...   详细内容>>

DNA测序仪/基因测序仪



第一代基因测序仪



第一代测序技术即Sanger链终止法为原理的测序技术。 

一代测序技术是20世纪70年代中期由Fred Sanger及其同事首先发明。其基本原理是,聚丙烯酰胺凝胶电泳能够把长度只差一个核苷酸的单链DNA分子区分开来。一代测序实验的起始材料是均一的单链DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每个分子的相同位置上退火,然后该寡聚核苷酸就充当引物来合成与模板互补的新的DNA链。用双脱氧核苷酸作为链终止试剂(双脱氧核苷酸在脱氧核糖上没有聚合酶延伸链所需要的3-OH基团,所以可被用作链终止试剂)通过聚合酶的引物延伸产生一系列大小不同的分子后再进行分离的方法。测序引物与单链DNA模板分子结合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反应分四组进行,每一组分别用四种ddNTP(双脱氧核苷酸)中的一种来进行终止,再用PAGE分析四组样品。从得到的PAGE胶上可以读出我们需要的序列。

第二代基因测序仪



第二代测序技术的核心思想是边合成边测序(Sequencing by Synthesis),即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列,现有的技术平台主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。

DNA测序(DNA sequencing)作为一种重要的实验技术,在生物学研究中有着广泛的应用。早在DNA双螺旋结构(Watson and Crick,1953)被发现后不久就有人报道过DNA测序技术,但是当时的操作流程复杂,没能形成规模。随后在1977年Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法,同年A.M.Maxam和W.Gilbert发明了化学降解法。Sanger法因为既简便又快速,并经过后续的不断改良,成为了迄今为止DNA测序的主流。然而随着科学的发展,传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要,对模式生物进行基因组重测序以及对一些非模式生物的基因组测序,都需要费用更低、通量更高、速度更快的测序技术,第二代测序技术(Next-generation sequencing)应运而生。这三个技术平台各有优点,454 FLX的测序片段比较长,高质量的读长(read)能达到400bp;Solexa测序性价比最高,不仅机器的售价比其他两种低,而且运行成本也低,在数据量相同的情况下,成本只有454测序的1/10;SOLID测序的准确度高,原始碱基数据的准确度大于99.94%,而在15X覆盖率时的准确度可以达到99.999%,是目前第二代测序技术中准确度最高的。虽然第二代测序技术的工作一般都由专业的商业公司来完成,但是了解测序原理、操作流程等会对后续的数据分析有很重要的作用,下文将以Illumina/Solexa Genome Analyzer 测序为例,简述第二代测序技术的基本原理、操作流程等方面。

Illumina/Solexa Genome Analyzer测序的基本原理是边合成边测序。在Sanger等测序方法的基础上,通过技术创新,用不同颜色的荧光标记四种不同的dNTP,当DNA聚合酶合成互补链时,每添加一种dNTP就会释放出不同的荧光,根据捕捉的荧光信号并经过特定的计算机软件处理,从而获得待测DNA的序列信息。

操作流程为:

1)测序文库的构建(Library Construction)

首先准备基因组DNA(虽然测序公司要求样品量要达到200ng,但是Gnome Analyzer系统所需的样品量可低至100ng,能应用在很多样品有限的实验中),然后将DNA随机片段化成几百碱基或更短的小片段,并在两头加上特定的接头(Adaptor)。如果是转录组测序,则文库的构建要相对麻烦些,RNA片段化之后需反转成cDNA,然后加上接头,或者先将RNA反转成cDNA,然后再片段化并加上接头。片段的大小(Insert size)对于后面的数据分析有影响,可根据需要来选择。对于基因组测序来说,通常会选择几种不同的insert size,以便在组装(Assembly)的时候获得更多的信息。

2)锚定桥接(Surface Attachment and Bridge Amplification)

Solexa测序的反应在叫做flow cell的玻璃管中进行,flow cell又被细分成8个Lane,每个Lane的内表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DNA 片段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构,以供后续的预扩增使用。

3)预扩增(Denaturation and Complete Amplification)

添加未标记的dNTP 和普通Taq 酶进行固相桥式PCR 扩增,单链桥型待测片段被扩增成为双链桥型片段。通过变性,释放出互补的单链,锚定到附近的固相表面。通过不断循环,将会在Flow cell 的固相表面上获得上百万条成簇分布的双链待测片段。

4)单碱基延伸测序(Single Base Extension and Sequencing)

在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP 、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增,在每一个测序簇延伸互补链时,每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光,测序仪通过捕获荧光信号,并通过计算机软件将光信号转化为测序峰,从而获得待测片段的序列信息。从荧光信号获取待测片段的序列信息的过程叫做Base Calling,Illumina公司Base Calling所用的软件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software and Pipeline Analysis Software。读长会受到多个引起信号衰减的因素所影响,如荧光标记的不完全切割。随着读长的增加,错误率也会随之上升。

5)数据分析(Data Analyzing)

这一步严格来讲不能算作测序操作流程的一部分,但是只有通过这一步前面的工作才显得有意义。测序得到的原始数据是长度只有几十个碱基的序列,要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架,或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上,并进一步分析得到有生物学意义的结果。

第三代基因测序仪



简介

基因测序仪的研发是系统工程,涉及生物、半导体、计算机、化学、光学等多个领域,需要不同学科顶尖力量的合作。目前真正被称为第三代测序技术的分别是Helicos公司的单分子测序技术、Pacific Biosciences公司的单分子实时(Single Molecule Real Time, SMRT)测序技术和Oxford Nanopore Technologies公司正在研究的纳米孔单分子测序技术。作为第三代测序仪的先驱——第一台单分子测序仪HeliScope正是美国Helicos公司的杰作,它的出现真正实现了单分子测序(Helicos由美国斯坦福大学教授、美国国家科学院院士斯蒂芬.奎克教授创立)。

特点

与二代测序仪比,三代测序仪完全是革命性的,它具有明显的几个优点:(1)单分子测序,大大提高了样本的通量和检测的速度;(2)RNA直接测序,大大降低了体外逆转录产生的系统误差;(3)长片段测序。当然,由于三代测序技术出现晚,三代测序仪器还不完善,存在着造价昂贵和测序误差高等不足。

技术原理

被称为第三代的测序的He-licos单分子测序仪,PacificBioscience的SMRT技术和Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的纳米孔单分子测序技术正向着高通量、低成本、长读取长度的方向发展。不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序,第三代分子测序,不需要进行PCR扩增。

(1)Helico BioScience 单分子测序技术。该测序是基于边合成边测序的思想,将待测序列随机打断成小分子片段并用末端转移酶在 3’ 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端进行荧光标记和阻断,把这些小片段与带有poly(T)的平板杂交成像来获得已经杂交模板所处的位置,建立边合成边测序的位点 加入聚合酶和被Cy3荧光标记脱氧核苷酸进行DNA 合成,每次只加入一种脱氧核苷酸,然后将未参与合成的dNTP和DNA聚合酶洗脱,直接对Cy3成像,观测模板位点上是否有荧光信号,然后化学裂解核苷酸上的燃料并释放 加入下一种脱氧核苷酸和聚合酶的混合物,进行下一轮反应。

(2)Pacific BioscienceSMRTT 技术。该测序也是基于边合成边测序的原理,这项技于使用了Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零级波导)。测序的过程:被荧光标记磷酸集团的核苷酸在聚合酶活性位点上与模板链结合(每种脱氧核苷酸被不用颜色的染料标记),被激发出荧光,在荧光脉冲结束后,被标记的磷酸集团被切割并释放,聚合酶转移到下一个位置,下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲,进行下一个循环。

(3)Oxford Nanopore Technologies 的纳米孔单分子测序技术。大多数纳米孔测序技术的基本原理是当DNA分子或者它的组成碱基从一个孔洞经过时而检测到被影响的电流或光信号。OxfordNanopore 测序技术是以α- 溶血素来构建生物纳米孔,核酸外切酶依附在孔一侧的外表面,一种合成的环糊精做为传感器共价结合到纳米孔的内表面。这个系统被镶嵌在一个脂双分子层内,为了提供既符合碱基区分检测又满足外切酶活性的物理条件,脂双分子层两侧为不同的盐浓度 在适合的电压下,核酸外切酶消化单链 DNA,单个碱基落入孔中,并与孔内的环糊精短暂的相互作用,影响了流过纳米孔原本的电流,腺嘌呤与胸腺嘧啶的电信号大小很相近,但胸腺嘧啶在环糊精停留是时间是其他核苷酸的2-3倍,所以每个碱基都因其产生电流干扰振幅是特有的而被区分开来。[3]

应用

第三代测序仪因为其高通量以及高速度、高准确度等优点,可广泛用于人类基因组测序生命科学、生物化学、生物医药等领域,广泛地应用临床医学、生物能源等,同时还能用于各种动植物如小麦、水稻、家蚕以及很多细菌的序列测定,对于生命健康研究起到了本质的推动作用。

意义

目前国内的基因测序技术主要以二代测序为主,第三代测序技术在中国乃至亚洲仍是空白。快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究的重要意义促使测序技术不断的进度,谁能在三代测序领域有所突破必将能登上世界生物科技领域之巅。这不仅将填补中国在基因测序基础装备领域的空白、提升装备自主化水平,同时也将使国内生命科学研究机构能获得低成本、高效率的测序工具,更有效地开发和利用中国丰富的基因资源,加速中国基因战略的发展。也对人类提高防备疾病,延长人类寿命将有积极的意义。

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2017/3/23 23:17:09