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基因扩增仪(PCR)百科

基因扩增仪(PCR)
基因扩增仪(PCR) 仪器简介 PCR是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。 PCR技术原理 该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链D...   详细内容>>

基因扩增仪(PCR)



仪器简介


PCR是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内In Vitro的大量合成,它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。根据DNA扩增的目的和检测的标准,可以将PCR仪分为普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类。

PCR技术原理


该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链。在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端,并以此为起始点,沿模板5´→3´方向延伸,合成一条新的DNA互补链。

PCR反应步骤


分别是1.变性,2.引物退火,3.引物延伸。 所谓变性是将DNA加热至90-95℃变性,将双链DNA加热后转为单链DNA做为复制的模板. 而引物退火则是引物于一定的温度下(冷却至55-60℃)附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶的作用下(加热至70-75℃)进行引物的延伸及另一链的合成。

PCR分类


1.普通PCR仪 

一次PCR扩增只能运行一个特定退火温度的PCR仪,叫做普通PCR仪。普通PCR仪由主机,加热模块,PCR管,热盖,控制软件组成。

普通PCR仪主要适用于分子生物学、医学临床诊断、食品工业、司法科学、生物技术、环境科学、微生物学、遗传学、基因芯片、基因检测、基因克隆、基因表达等领域。

2.梯度PCR仪

在一次性PCR扩增中可以设置一系列不同的退火温度条件(温度梯度),通常12种温度梯度,这样的仪器就叫梯度PCR仪。因为被扩增的不同DNA片段,其最适退火温度不同,通过设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增,就可以筛选出扩增量高的最适退火温度,进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样节约成本的同时也节约了时间。

梯度PCR仪,在不设置梯度的情况下也可以做普通PCR扩增。和普通基础PCR仪一样,梯度PCR仪可用于医学,食品,司法,科研,教学等领域。

3.实时荧光定量PCR仪

在PCR反应体系中加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,叫做实时荧光定量PCR技术,也称real-time Q-PCR。

其PCR扩增原理和普通PCR仪扩增原理相同,只是PCR扩增时加入的引物是利用同位素、荧光素等进行标记,使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合扩增。扩增的结果通过荧光信号采集系统实时采集信号连接输送到计算机分析处理系统得出量化的实时结果输出。

荧光定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上增加一个荧光信号采集系统和计算机分析处理系统,与普通PCR仪,梯度PCR仪相比,无需做电泳分析,实验一步检测完成。荧光检测系统主要包括激发光源和检测器。激发光源有卤钨灯光源、氩离子激光器、发光二极管LED光源,前者可配多色滤光镜实现不同激发波长,而单色发光二极管LED价格低、能耗少、寿命长,不过因为是单色,需要不同的LED才能更好地实现不同激发波长。监测系统有超低温CCD成像系统和PMT光电倍增管,前者可以一次对多点成像,后者灵敏度高但一次只能扫描一个样品,需要通过逐个扫描实现多样品检测,对于大量样品来说需要较长的时间。

荧光定量PCR仪有单通道,双通道,和多通道。当只用一种荧光探针标记的时候,选用单通道,有多荧光标记的时候用多通道。单通道也可以检测多荧光的标记的目的基因表达产物,因为一次只能检测一种目的基因的扩增量,需多次扩增才能检测完不同的目的基因片段的量。

荧光定量PCR仪可用于医疗,新药研发,诊断检验试剂研发等领域。

在医疗方面,具体可用于病原体检测;产前诊断以防止各类遗传性疾病的发生;药物疗效考核,例如对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示:病毒量与某些药物的疗效关系;肿瘤基因检测。

在新药开发研究中,实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量,因此有利用分析药物的作用效果,为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。

在新诊断及检验试剂的开发中,现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求,而荧光定量PCR方法可以做到这一点,从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂,从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等;这类试剂的种类是非常多的,所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。

由于荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点,其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的,如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等;研究人员也可以根据自已研究项目开发其新的用途。

4.原位PCR仪

原位PCR仪是在组织细胞里进行PCR反应的一种基因扩增仪。它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,可以对细胞或组织内的DNA片段进行原位扩增分析—即定位分析。原位PCR仪由主机,加热模块,玻片,热盖,控制软件组成。

普通的PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA,但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位,因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系,这是该技术一个局限性。原位杂交虽具有良好的定位能力,但由于其敏感性问题,尤其是在石蜡切片中,尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列。而原位PCR可使扩增的特定DNA片段在分离细胞和组织切片中定位,从而弥补了PCR和原位杂交的不足。

原位PCR反应是在载玻片的平面上进行,保持水平可以使反应各组分均匀地分布在组织切片上,所以须在原位PCR仪上进行,该仪器不但可以使载玻片保持水平,而且还可以给载玻片进行均匀地加热,保证扩增反应的顺利进行。

原位PCR仪是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术,目前应用还不太广泛。原位PCR既能分辨鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,于分子和细胞水平上研究疾病的发病机理和临床过程及病理的转变有重大的实用价值。
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2017/3/23 5:13:36