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蛋白质纯化系统百科

蛋白质纯化系统
蛋白质层化系统凝胶过滤、离子交换、疏水层析、反向层析和亲和层析等方法,分离和纯化各种生物分子,包括天然蛋白质,重组和融合蛋白质、肽、寡核苷酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等。 蛋白质层化系统应用范围 快速完成纯化生物分子蛋白质、核酸、肽等,完成从实验室基础研究到整个工艺方法快速开发及放大。 进行生物大分子的范例纯化,已知和未知蛋白质的纯化,蛋白质的结构动力学药物作用靶点研究,药物蛋白的分离,蛋白质工程药物的合成,蛋白质的定性,组织细胞中各种蛋白质在生物体中如何发展功能,基因表达产物...   详细内容>>

蛋白质层化系统凝胶过滤、离子交换、疏水层析、反向层析和亲和层析等方法,分离和纯化各种生物分子,包括天然蛋白质,重组和融合蛋白质、肽、寡核苷酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等。

蛋白质层化系统应用范围


快速完成纯化生物分子蛋白质、核酸、肽等,完成从实验室基础研究到整个工艺方法快速开发及放大。

进行生物大分子的范例纯化,已知和未知蛋白质的纯化,蛋白质的结构动力学药物作用靶点研究,药物蛋白的分离,蛋白质工程药物的合成,蛋白质的定性,组织细胞中各种蛋白质在生物体中如何发展功能,基因表达产物的分离。 

检测、分离、纯化多种生物样品,有效地针对各种样品:植物、动物、人类生物体,检测、纯化、分离特异性生物小分子。

蛋白质层化系统层析分类


吸附层析

指混合物随流动相通过固定相时,由于吸附剂对不同物质的不同吸附力,而使混合物分离的方法。它是各种层析技术中应用最早的一类,至今仍广泛应用于各种天然化合物和微生物发酵产品的分离、制备。 

吸附是表面的一个重要性质,任何两相都可以形成表面,其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在此表面的密集现象称为吸附。在固体与气体之间或在固体与液体之间的表面上都可以发生吸附现象。当气体或溶液中某组分的分子在运动中碰到一个固体表面时,分子会贴在固体表面上并停留一定的时间,然后才离开。这时气体或溶液中的组分分子在固体表面的浓度就会高于其在气体或溶液中的浓度。 

在液体与气体之间的表面上,也可以发生吸附现象。凡能将其他物质聚集到自己表面上的物质,都称为吸附剂。聚集于吸附剂表面的物质就称为被吸附物。在不同条件下,吸附剂与被吸附物之间的作用,既有物理作用的性质又有化学作用的特征。物理吸附又称范德华吸附,因为它是分子间相互作用的范德华力所引起的。其特点是无选择性,吸附速度快,在相同条件下,吸附过程和脱附过程是同时进行的(可逆的),因此被吸附的物质在一定条件下可以被解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡,称为吸附平衡。层析过程就是不断地形成平衡与不平衡、吸附与解吸的矛盾统一过程。

分配层析技术

各物质在两相中扩散速度不同,产生不同的分配系数。分配层析分离技术是利用各物质不同分配系数,使混合物随流动相通过固定相时而予以分离的方法。 

分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中的溶解达到平衡时,该溶质在两相溶剂中所具浓度的比例。不同物质因其性质不同而有不同的比例,也就是有不同的分配系数。现在应用的分配层析技术,大多数是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂,此极性溶剂在层析过程中始终固定在此多孔支持物上而被称为固定相。另用一种与固定相不相溶的非极性溶剂流过固定相,此移动溶剂称为流动相。如果有多种物质存在于固定相和流动相之间,将随着流动相的移动进行连续的、动态的不断分配,由于各种物质的分配系数相近,移动距离就必须相当长才能分开。反之,两种物质的分配系数相差越大,彼此分开时的移动距离就越短。因此,必须根据实际情况,选定作为固定相用的层析柱或滤纸的长度。 

分配层析中应用最广泛的是以滤纸为多孔支持物的纸上分配层析。其次是以硅胶、硅藻土、纤维素粉、淀粉、微孔聚乙烯粉等多孔支持物的分配层析。还有直接使物质在两种不相溶的溶剂中进行分配的常压液相分配层析和高压液相分配层析。 

分配层析以分配系数为依据,在等温等压条件下可用下式表示。K=K2/K1,式中K为分配系数;K2是物质在固定相中的浓度; K1是物质在流动相中的浓度。分配系数与温度、溶质和溶剂的性质有关,各种物质有不同的分配系数。

纸上分配层析

纸上分配层析是以滤纸为惰性支持物的。滤纸纤维和水有较强的亲和力,能吸收22%的水,而且其中6~7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合,在一般条件下较难脱去。而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱,所以一般的纸上分配层析实际上是以滤纸纤维及其结合水作为固定相,以有机溶剂作为流动相。当有机相沿纸经过样品点时,样品点上的溶质在水相和有机相之间进行分配,一部分溶质离开原点随有机相移动,进入无机溶质区,此时又重新进行分配,一部分溶质从有机相移入水相。当有机相不断流动时,溶质也就不断进行分配,沿着有机相方向移动。溶质中各种不同组分有不同的分配系数,移动速率也不相同,从而使物质得以分离和提纯。 

薄层层析分离技术
将作为固定相的支持剂 (吸附剂或其它)涂于支持板上(一般为玻璃板) 进行的一种层析技术。如果支持剂是吸附剂,层析时的主要依据是吸附力的不同,应属吸附层析,又因此种吸附层析是在薄板上进行,故名薄层吸附层析。如果支持剂是纤维素,其层析的主要依据是分配系数的不同,应属分配层析,因在薄板上进行,故名薄层分配层析。同理,薄板上涂以离子交换剂,分离作用的主要依据为离子交换而名薄层离子交换层析; 薄板上涂以凝胶过滤剂,分离作用主要依据为分子量的大小,而名薄层凝胶层析。

聚酰胺薄膜层析

指混合物流动相通过聚酰胺薄膜时,由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的强弱不同,而将混合物分离的方法。

气相层析

也称气相色谱。它与一般层析法的区别主要在于用气体代替液体作为扩展剂或洗脱剂,因此也同样有吸附气体层析法(气固层析法)和分配气体层析法(气液层析法)两种操作形式。实际应用中以后者为常用。

特点:①气体粘度小,气相与液相(固定相)间的质量传递率高,容易达到平衡,当使用高的气相流速时可缩短分离时间,分析常在几分钟到几十分钟内完成,使用长的层析管能提高分离效率;②检定气体中的组分比检定液体中的组分容易,已有许多简单与灵敏的仪器可以利用,并可设法使检定工作自动化,节省人力和时间,它也可与红外、质谱等组合以提高分析效果; ③气液层析法中固定相液体的选择范围很广,操作温度范围也很宽,两者配合,可将结构相似或沸点相近的物质分开;④检定器灵敏,样品用量很少,一般固体样品只需若干μg至mg;液体样品量1μl至几百μl;气体样品0.1 ml至10ml。 

混合物样品随固定流速的载体(常用惰性气体)进入层析柱。样品必须是气态的,如为液态或固态则需先气化再进入层析柱。层析柱内装有称为担体(树脂)的颗粒状隋性支持物,其表面为一类具有高沸点的有机化合物(称固定液)均匀地包裹着,使担体表面形成一层很薄的液膜。样品气体进入层析柱遇到这种固定液时,就能溶解在固定液中,遇热又能挥发到载体里去,并随载体的定向流动而向前推进,以至又遇到新的固定液而被吸收。如此交替地吸收和挥发,使样品蒸汽所经过的每一个点上都进行着固定相和流动相之间的分配平衡,由于样品中各组分在固定液和流动相里的溶解度不同(即分配系数不同),在层析柱内向前移动的速度也不相同。分配系数大的组分,易溶于固定液内,在固定液中停留的时间就长些,移动的速度也就慢些,分配系数小的组分不易溶于固定液,移动速度就快。经过一段时间后,原来均匀混合的样品组分彼此就分开了,被分离的组分按先后次序被载体带入鉴定器,在那里把进入的样品浓度转换成电压,经放大后在自动记录仪上记录下来,得到气相层析曲线图。从给样到每一组分出现在层析峰上的时间称保留时间,不同化合物在一定条件下有其特定的保留时间。还可根据峰面积来计算各种化合物的浓度。

高压液体层析

又称高效液相层析(或色谱)。其分离分析原理和经典的液体层析基本相同,但它采用了特有的固定相液体,加上在高压下工作,又与自动分析仪器相结合,成为一种高效的分析方法。广泛用于药物、杀虫剂、高分子量芳香族化合物、增塑剂、抗生素、各种有机试剂以及核酸、核苷酸类物质的分离分析。 

高压液体层析特点是采用长 (50~100cm) 而细(柱径2~3mm)的层析柱,柱内填充物的粒度较细(直径10~15μm),在高压下操作,因而分析速度很快。一般可分为以下4类:①液-液分配层析。利用溶质在流动相中分配系数的差别而达到分离的目的,是应用最多的方法之一; ②液-固吸附层析。利用溶质在固体吸附剂上吸附能力的差别,而达到分离目的; ③离子交换层析。通过溶质和担体的离子交换作用,利用不同溶质离子交换能力的差别,而达到分离目的;④凝胶渗透层析。按溶质分子量大小而分离,也即分子筛层析。 

高压液体层析中常用的担体是聚苯乙烯凝胶、多孔性二氧化硅微球、多孔玻璃珠等,这些层析担体对高分子化合物及表面活性剂的分离很有效。

而按层析原理还可将层析分为: 

1.凝胶层析:又称分子筛过滤或排阻层析等。医学教育网搜集整理固定相是多孔凝胶,各组分的分子大小不同,因而在凝胶上受阻滞的程度也不同。本法的优点是所用凝胶属于惰性载体,吸附力弱,操作条件温和,不需要有机溶剂,对高分子物质有很好的分离效果。常用的凝胶有Sephadex G系列。凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。 

2.离子交换层析:采用具有离子交换性能的物质作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质,也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。 

3.高效液相层析(HPLC):在经典液相层析法基础上,引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点,对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利,根据流动相和固定相相对极性,高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。 

4.亲和层析:利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力,从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂,当含混合组分的样品通过此固定相时,只有和固定相分子有特异亲和力的物质,才能被固定相吸附结合,性无关组分随流动相流出。改变流动相组分,可将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质,与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有:抗原与抗体,DNA与互补DNA或RNA,酶与底物、激素与受体、维生素与特异结合蛋白、糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。
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2017/3/30 8:29:05