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2016年11月全球CRISPR/Cas9取得重大进展梳理

仪器信息网 2016/11/30 17:30:05 点击 1349 次
标签CRISPR/Cas基因编辑
默克工艺解决方案
[导读] 2016年11月28日,基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

  2016年11月28日,基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一,受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称,Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas9最初是在细菌体内发现的,是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。

  接下来,小编列举最近一段时间CRISPR基因编辑系统取得的重大进展,详情如下所示。

  1.Nature:利用MEMOIR方法读取细胞的历史

  doi:10.1038/nature20777

  在一项新的研究中,来自美国加州理工学院的研究人员开发出一种新的方法来读取细胞的历史和“谱系图”。 这种被称作光学原位读取人工突变存储(Memory by Engineered Mutagenesis with Optical In situ Readout, MEMOIR)的方法能够记录动物细胞的生命历史---它们与其他细胞之间的关系,沟通模式和影响它们的重大事件。相关研究结果于2016年11月21日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“Synthetic recording and in situ readout of lineage information in single cells”。

  两种新的强大工具有助实现这个目标。在一种被称作基因组编辑的工具中,在DNA切割系统CRISPR的帮助下,一种发育中的有机体的遗传密码能够在任何指定的靶位点上发生改变。写在一个细胞基因组中的任何改变可传递给它的后代。在动物发育早些时候发生的改变将出现在它的很多细胞中,然而较为近期的改变将出现在更少的细胞中。通过分析发生的DNA编辑模式,研究人员能够鉴定出这些细胞的共同祖先和计算出它们的亲缘关系如何,比如,他们能够确定哪些细胞是兄弟姐妹。类似的方法已被用于多种科学领域,包括中世纪史。

  另一种工具,被称作顺序单分子荧光原位杂交(sequential single molecule Fluorescence In Situ Hybridization, seqFISH),是由Cai开发的,用于了解哪些基因在单个细胞中是有活性的。在最近的一篇发表在Neuron期刊上的论文中,Cai团队展示了这种技术如何能够被用来确定200多种基因在单个细胞中的表达水平。这种方法也让研究人员在细胞的体内起源位置处分析它的基因活性。之前的技术需要这些细胞与它们的自然环境相分离。

  在这项新的研究中,研究人员将这两种工具结合在一起:seqFISH方法被用来追踪通过CRISPR基因编辑引入到基因组中的变化。

  这个系统不仅能够被用来了解细胞谱系信息,而且也能够被用来了解这些细胞过去发生的事件---它们何时接收来自彼此的信息或者它们何时从一种细胞类型变成另一种细胞类型。比如,当肿瘤产生时,一些细胞可能接受来自其他细胞的不同分子信号,从而引发截然不同的命运。一种细胞可能变成转移性的和能够迁移,而另一种细胞保持静止不动。追踪过去的信号如何影响当前的细胞命运的能力可能为肿瘤的时空发育提供一种新的视角。

  2. ACS Nano:继全球首次人体临床实验后,川大华西CRISPR研究再获新进展

  doi:10.1021/acsnano.6b04261

  近日,来自四川大学华西生物治疗国家重点实验室的魏于全院士课题组首次采用人工病毒进行CRISPR-Cas9基因编辑系统输送,成功在小鼠肿瘤模型中完成了靶基因编辑,达到了较好的肿瘤治疗效果,相关成果发表在《美国化学学会·纳米》杂志上。

  。虽然目前为止已经有不少研究用CRISPR进行肿瘤基因编辑,但是这些研究存在着不少问题,使用的方法临床转化也相当困难。目前研究采用的体内给药CRISPR-Cas9质粒DNA的手段主要有三种,一种是水流动力学注射,即将约为小鼠体重10%的DNA质粒注射液通过尾静脉在3-8秒内注射到小鼠体内(脑补一下打点滴时的情形),这会造成血压瞬间升高,可能造成器官损伤,在人体内几乎无法实现;另一种方式则是采用腺病毒载体进行CRISPR质粒DNA的输送,但是腺病毒具有免疫原性,有引发免疫反应的风险,最重要的是由于CRISPR质粒DNA太大,腺病毒负载能力实在太低,因此效率不高,心有余而力不足;第三种则是局部注射质粒,其缺点不言而喻,对于人体深部疾病似乎鞭长莫及啊。

  基于此,魏于全院士课题组合成了一种新型的人工病毒载体用于CRISPR-Cas9质粒DNA的输送,他们合成了靶向乳腺癌中的MTH1基因(一个可以促使基因组稳定、阻止细胞死亡的基因,乳腺癌病人肿瘤组织高表达)的CRISPR-Cas9质粒DNA(Cas9-hMTH1)在小鼠体内进行了实验验证。由于质粒DNA带负电,他们选择了带正电的氟原子修饰的聚乙烯亚胺(PF33)与质粒DNA混合,通过正负电荷相互作用形成人工病毒(PF33/ Cas9-hMTH1,实际上就是一种纳米颗粒),同时为了增强人工病毒的输送効率,他们采用一种多功能高分子RGD-R8-PEG-HA对人工病毒进行修饰得到了靶向MTH1的多功能核壳结构CRISPR-Cas9输送人工病毒(RRPHC/Cas9-hMTH1),这种高分子可以使人工病毒更稳定,同时避免被免疫系统清除,RGD和HA可以同时靶向结合肿瘤部位高表达的整合素ανβ3和CD44受体,从而提高人工病毒在肿瘤部位的富集。同时,肿瘤部位高表达的透明酸质(HA)酶可以降解HA,促进Cas9-hMTH1在肿瘤中的释放,从而增强疗效。

  体外细胞转染实验表明该人工病毒的转染效率明显高于商用转染试剂SuperFect、Lipofectamine 2000及Lipofectamine 3000,表明该载体可以更有效携带Cas9-hMTH1进入细胞,同时双重靶向策略可以使该人工病毒更特异性结合并进入乳腺癌细胞完成基因敲除。功能性实验表明该人工病毒可以成功敲除MTH1,导致癌细胞凋亡,显着抑制乳腺癌细胞增殖。通过小鼠尾静脉注射人工病毒(仅含5 微克 Cas9-hMTH1,而文献报道水动力学注射需要100 微克左右)后,可发现小鼠肿瘤组织有较多的人工病毒富集,免疫组化分析也显示肿瘤部位MTH1蛋白表达量显着降低,同时小鼠肿瘤生长及转移也得到了明显的抑制。最后他们对人工病毒的安全性进行了评价,血细胞计数发现注射人工病毒对血细胞数量无明显影响,基因测序显示正常组织中的突变率均低于0.4%,且都不是插入或者缺失突变,仅为单碱基替换突变。

  虽然他们认为该人工病毒具有较好的安全性,可以用于肿瘤特定基因的敲除进行肿瘤治疗,但是笔者认为0.4%的突变率是不是还是有点高呢,有没有办法再优化一下继续降低脱靶率呢?据报道,他们下一步的研究计划是使用这种人工病毒输送其他CRISPR-Cas9质粒DNA及功能化的DNA结合蛋白用于拓展该人工病毒的应用范围。

  3.利用CRISPR研究基因组“暗物质”

  超过98%的人类基因组由非编码基因组成。这些非编码基因被称为基因组的“暗物质”,它们能调控编码基因的表达,从而影响人类健康和疾病进程。自从人类基因组序列被公开发表以来,科学家们努力解析基因中的功能元件,包括非编码调节区——参与转录调节的顺式调节区和非编码RNA(ncRNA)。转录因子在整个基因组中可能有数百至数千个结合位点,因此研究起来非常复杂。目前常用的两种研究转录因子调控基因表达位点的方法是:1,耗时且复杂的增强子研究;2,在非天然状态中克隆增强子或启动子序列,开展并行研究。最近Sanjana等人和Fulco等人的研究都指出,可以利用CRISPR技术在天然状态里研究非编码调控元件的功能。

  大规模的生化试验使人们发现了由潜在的、被数百种蛋白靶向结合的调节序列。值得一提的是,识别脱氧核糖核酸酶I超敏感位点(deoxyribonuclease I hypersensitive site, DHS)和大规模染色质免疫沉淀测序(chromatin immunoprecipitation–sequencing, ChIP seq)方法的提出,让科学家们能够全面地解析蛋白与染色质结合的情况。然而,把这些分子和功能调控联系起来非常困难。

  由于使用不同的CRISPR载体可以无偏向性地敲除蛋白编码基因,因此CRISPR筛选是研究非编码基因功能的有力工具。与人类细胞中NGG(前间区序列邻近基序)序列上游的基因序列同源的单引导RNA(single guide RNA, sgRNA)可以引导CRISPR系统到达特定基因组位点,从而特异性地引起突变。首个CRISPR“敲除”筛选研究在基因组规模上诱导了全基因敲除,并克服了RNA干扰筛选中的诸多限制,例如脱靶效应和敲除不完全(图:CRISPR-Cas9筛选方法)。

  Sanjana等人使用CRISPR工具来研究黑色素瘤细胞中调控vemurafenib(B-Raf蛋白V600E突变中,600位点的缬氨酸被谷氨酸所替代,而Vemurafenib抑制携带了V600E突变的B-Raf蛋白中的丝氨酸 – 苏氨酸蛋白激酶结构域)抗性的序列。研究人员使用CRISPR工具靶向主要的抗性调节区域——NF1(neurofibromatosis type 1,神经纤维瘤病1型基因)、NF2(neurofibromatosis type 2,神经纤维瘤病2型基因)和CUL3(cullin 3,泛素连接酶3)。该方法中,向导RNA和反式激活crRNA(trans-activating crRNA)融合,引导来源于酿脓链球菌的Cas9(spCas9)在目标位点处诱导DNA双链断裂,从而产生突变。结果显示,靶向CUL3的sgRNA在转录起始点最为富集。sgRNA富集的区域,CUL3被敲除,这表明,CUL3似乎与染色体相互作用、组蛋白翻译后修饰,以及转录因子结合位点阻断的调控区域相关。

  Fulco等人利用CRISPR干扰系统,即利用失活的Cas9和KRAB蛋白融合,沉默靶向序列的表达。这种方法虽然实现了靶向性的基因沉默,但并未引起基因突变。研究者们设计的靶向序列围绕在MYC和GATA1基因附近(这两个基因能调控K562红白血病细胞的增殖)。他们首先使用病毒感染细胞,将CRISPRi系统载带进入细胞,然后使用多西环素诱导dCas9靶向目标序列。他们发现,sgRNA富集点恰好和包含多个转录因子结合位点的DHS重合。更有趣的是,dCas9靶向GATA1或组蛋白脱乙酰酶6(HDAC6)增强子时,都会减少HDAC6表达。这表明,对于共同的增强子(GATA1和HDAC6存在共同的增强子),基因之间存在竞争关系。鉴定出来的MYC增强子的位置与转录起始位点、CCCTC-结合因子(CTCF,介导染色质相互作用)结合位点都是吻合的。这可能是MYC调控细胞增殖的机制。

  4.基因编辑器CRISPR让突变小鼠触手可得

  如今,绝大多数小鼠培育者都知道CRISPR。长久以来,JAX和其他培育新的小鼠品系的实验室依赖于一个辛苦费力的多步骤过程,其中涉及利用基因工程技术改变小鼠的胚胎干细胞,将其注射进胚胎,并且培育若干代小鼠。即便是JAX最好的团队,也需要用2年时间才能成功改造一只小鼠。CRISPR利用一种可在受精卵上开展针对性基因手术的分子复合物替代了所有这一切。它能在6个月内产生一种被改造的小鼠。

  Jaenisch首次证明了CRISPR在产生基因敲除小鼠方面的威力。在研究人员首次证实CRISPR在哺乳动物细胞中奏效的5个月后,Jaenisch和同事于2013年5月在《细胞》杂志上发表了一篇论文。他们报告称,该技术成功断开了一组小鼠胚胎干细胞中的5个基因,而这在以前是不可能的。更重要的是,他们证实可完全绕过胚胎干细胞,并且同时敲除单细胞小鼠受精卵中的两个基因。研究人员不再需要改造胚胎干细胞并不辞辛苦地培育若干代小鼠,以产生卵子或精子细胞中携带基因突变的小鼠。同时,研究人员若想培育拥有两个突变的小鼠,也不再需要将单突变体杂交并经历一个类似的耗时且烦琐的流程,以获得拥有被改变生殖细胞系的小鼠后代。

  自此以后,已有500余篇论文详细描述了CRISPR如何敲除以及敲入小鼠基因。“它产生的影响是巨大的。”在1974年培育出首个转基因小鼠的Jaenisch表示。加拿大多伦多大学生物化学家Tak Mak则认为,此项技术真正改变了获得这些被改造动物的时间和效率。据Mak估测,和利用胚胎干细胞相比,利用CRISPR改造小鼠的花费要便宜30%左右,从而使他的平均成本大大降低。

  CRISPR的影响不能仅通过节省成本来衡量。此项技术的便利和速度使得在匆忙之中改造小鼠成为可能,从而解决了来自多伦多病童医院的C. C. Hui最近面临的特定问题:在基因敲除过程中,缺失基因未产生任何可观察到的效应。Hui意识到,被敲除的基因同另一个可能对其作出补偿的基因存在关联。他向在多伦多表型基因组学中心监管小鼠培育的Lauryl Nutter求援。Nutter利用CRISPR使来自初始基因敲除过程的受精卵中的干扰基因发生突变。“我们获得了受精卵,将CRISPR-Cas9注射进去。8周后,Hui便获得了双突变体。”Nutter介绍说,“如果利用胚胎干细胞,可能需要好几年才能完成。”

  5.Nature:中国首次利用CRISPR–Cas9编辑过的细胞开展人体临床试验

  doi:10.1038/nature.2016.20988

  来自中国成都市四川大学华西医院的一个研究人员团队首次将利用CRISPR–Cas9进行过基因编辑的细胞注射到一名病人体内。《自然》期刊报道这一注射过程是在2016年10月28日发生的,而且迄今为止,这名病人表现得 “还不错”。

  经过基因修饰的细胞之前已被注射到人体内,但是是利用不同的技术实现的。CRISPR-Cas9被认为是一种更加高效的方法。在这项新的努力中,该团队从血液样品中分离出免疫细胞,然后利用CRISPR-Cas9寻找它们中的PD-1蛋白,并且让该蛋白不能发挥功能,而之前的研究已证实这会延缓免疫细胞作出的免疫反应。人们的看法是让这种蛋白失去功能将允许免疫系统更强地抵抗肿瘤生长。这些利用CRISPR-Cas9进行过基因编辑的细胞被放置在一个容器中,在那里,它们在体外培养后能够发生增殖---它们随后经收集后被注射到一名肺癌病人体内,其中这名病人已不能够对任何其他的疗法作出反应。

  这种CRISPR-Cas9技术涉及利用一种结合特定DNA序列的向导RNA和一种能够在事先选择的位点上切割DNA链的Cas9酶,从而允许移除DNA链,或者加入新的DNA片段。

  这项研究是由四川大学华西医院肿瘤学家卢铀教授领导的。它涉及一名已接受注射的病人和9名其他的志愿者。

  卢铀团队披露出,这名病人已被安排第二次接受利用CRISPR–Cas9进行过基因编辑的免疫细胞注射,但是未给出具体的时间。这名病人和这项临床试验的9名其他的志愿者将被密切监控6个月的时间来确定这些接受过基因编辑的细胞是否会导致任何不良影响---直到那时卢铀团队才会着重关注这些细胞是否确实在延缓或逆转癌症生长中发生影响。

  6.Nature:重磅!首次利用CRISPR-Cas9对非分裂细胞进行基因编辑

  doi:10.1038/nature20565

  在一项新的研究中,来自美国沙克研究所的研究人员发现基因编辑的圣杯---首次能够在基因组的靶位点上将DNA插入到非分裂细胞(non-dividing cell)中,其中非分裂细胞占成年器官和组织中的大多数。他们证实这种技术能够部分恢复失明的啮齿类动物的视觉反应。它将为基础研究和多种治疗视网膜疾病、心脏疾病和神经疾病等疾病的方法打开新的途径。相关研究结果于2016年11月16日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration”。

  在此之前,修饰DNA的技术---如CRISPR-Cas9系统---已最为有效地利用分裂细胞(dividing cell)的正常复制机制在这些细胞(如在皮肤或肠道中的那些细胞)当中在发挥作用。沙克研究所开发的这种新技术在将新的DNA整合到体外培养的分裂细胞中的效率比其他方法高10倍,使得它成为一种大有希望的用于研究和药物开发的工具。但是,更为重要的是,这种新技术首次代表着科学家们成功地将一种新的基因插入到不再发生分裂的成体细胞(如在眼睛、大脑、胰腺或心脏中的那些细胞)中准确的DNA位点上,从而为在这些细胞中进行治疗应用提供新的可能。

  为了做到这一点,研究人员瞄准一种被称作非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)的DNA修复细胞通路,其中NHEJ通过将发生常规断裂的DNA链末端重新连接在一起对断裂的DNA进行修复。他们将这个过程与现存的基因编辑技术组合使用,从而成功地将新的DNA插入到非分裂细胞中的精确位点上。

  7.Nature子刊:北大魏文胜、哈佛刘小乐课题组完成首次CRISPR lncRNA基因高通量功能筛选

  doi:10.1038/nbt.3715

  CRISPR–Cas系统是近年来兴起的一种高效的基因编辑技术,具有广泛的应用范围,其中就包括功能基因筛选。人们可以建立一个单链向导RNA(sgRNA)的库,用其中的sgRNA去靶向作用于多种基因的编码区域,然后再以所研究功能相关的目标表型对结果进行评估,从而找到与该功能相关的基因。

  这一策略利用了细胞中倾向于产生差错DNA修复途径——非同源性末端接合(NHEJ),通过CRISPR–Cas系统在目标基因片段中制造DNA双链断裂,是细胞采用NHEJ进行修复,最终在原断裂位点留下插入/缺失突变。对于编码蛋白的基因,少数碱基对的加入或去除便可能带来移码突变、错义突变等严重影响蛋白正常功能的因素,最终反映在表型上。

  然而,对于转录非编码RNA的基因来说,上述策略则难以用于功能筛选,因为仅有插入/缺失突变很可能并不能显着影响转录产物的表型。为此,人们需要制造影响更大的突变,比如基因中大片段的缺失,以造成可观察到的表型改变,而这样的突变可以通过配对向导RNA(pgRNA)来实现。CRISPR–Cas系统在两种分别靶向目标基因不同位点的gRNA的指导下,在同一基因中造成两处DNA双链断裂。在细胞对DNA进行修复的过程中,上述两个断裂点之间的基因片段可能会被“遗漏”,最终不会出现在修复完毕的基因中。

  最近,北京大学魏文胜教授和哈佛大学刘小乐教授的联合团队基于上述策略,以慢病毒为载体构建出pgRNA库,在全基因组范围内对人源肝癌细胞系Huh7.5OC中的近700个癌症或其他疾病相关长链非编码RNA(lncRNA)的基因进行了功能筛选。这一成果发表于近期的Nature子刊《Nature Biotechnology》上。

  研究者以细胞增殖为表型,采用MAGeCK算法对lncRNA基因敲除影响的显着性进行了分析,最终筛选出了43种和8种在敲除后分别抑制(即负向选择)和促进(即正向选择)细胞增殖的lncRNA基因。在接下来的验证性分析中,研究者选取了5种负向选择和4种正向选择lncRNA,在Huh7.5OC细胞中对其进行了敲除、回补、转录激活或抑制处理,结果均符合其对细胞增殖或存活等方面的影响。在上述9个lncRNA中,正向选择的LINC01087还被进行了进一步的功能分析。结果显示,LINC01087的敲除导致一系列肝癌相关基因的表达上调,如FOS和FOSB等。

  8.Nature:利用CRISPR/Cas9治疗镰状细胞疾病取得重大进展

  doi:10.1038/nature20134

  在一项新的研究中,来自美国斯坦福大学医学院的研究人员利用一种被称作CRISPR/Cas9的基因编辑工具修复人干细胞中导致镰状细胞疾病的基因。这是开发一种治疗这种疾病的基因疗法的关键一步。相关研究结果于2016年11月7日在线发表在Nature期刊上,论文标题为“CRISPR/Cas9 Beta-globin Gene Targeting in Human Hematopoietic Stem Cells”。论文第一作者是博士后研究员Daniel Dever博士和Rasmus Bak博士,论文通信作者是Matthew Porteus博士。

  研究人员继续证实这些被修复的干细胞能够制造功能性的血红蛋白分子---在正常的红细胞中,这些分子携带氧气---并且成功地将这些干细胞移植到小鼠体内。他们说这项研究代表着一种修复镰状细胞疾病和地中海贫血等血源性遗传疾病的概念验证。

  Porteus说,在之前的研究中,他已利用较为老旧的基因编辑技术靶向镰形细胞基因,但是利用这种新的CRISPR/Cas9基因编辑技术开展研究更为快速和更加简单。他注意到,“我们花了6年时间试图利用这种旧的基因编辑技术靶向β-珠蛋白基因”,并且补充道,利用CRISPR/Cas9技术仅需一周时间,他们就拥有一种发挥更好作用的基因编辑工具。

  CRISPR/Cas9基因编辑工具是一种切割靶DNA序列的Cas9酶和一种将这种酶精确地带到你想要进行切割的位点---在这项研究中,指的是镰形细胞突变位点---的向导RNA(gRNA)。一旦这些发生突变的DNA序列被移除,其他的工具能够协助接入一种正常的DNA序列拷贝。

  Porteus团队利用从镰形细胞疾病患者的血液中获得的造血干细胞开展研究,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术校正这种基因突变,随后对这些造血干细胞进行浓缩以便它们中的90%携带获得校正的镰形细胞基因。该团队将这些浓缩后的获得校正的造血干细胞注射到年轻的小鼠体内。

  当16周后,Porteus团队研究这些小鼠的骨髓时,这些得到校正的造血干细胞在那里茁壮成长,并且开始制造其他的血细胞。

  Porteus说,这些获得校正的红细胞不需要替换病人体内所有的镰形细胞。如果镰形细胞的比例低于30%,那么病人不会产生疾病症状。他说,获得校正的细胞具有的优势大约是未得到校正的细胞的10倍。这是因为受到镰形细胞影响的红细胞倾向于呈镰形,而且平均仅10天后就会死掉。相比之下,获得校正的细胞具有正常红细胞的寿命:大约120天。因此,这些获得校正的细胞的数量快速地超过未获得校正的细胞的数量。

  9.PNAS:在小鼠细胞中利用CRISPR-Cas9技术高效进行基因组编辑

  doi:10.1073/pnas.1613884113

  为了利用CRISPR-Cas9基因编辑系统切割基因,人们必需设计一种与靶基因的DNA相匹配的RNA序列。大多数基因具有上百个这样的在基因组中的活性和独特性上存在差异的序列。因此,寻找最佳的序列很难通过手工实现。一种新的“CrispRGold”程序有助科学家们鉴定出最为高效的和最为特异性的RNA序列。这种程序是由德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心科学家Klaus Rajewsky教授领导的一个研究团队开发的。该团队也开发出一种新的已携带Cas9蛋白的模式小鼠。将这种模式小鼠和这些可靠的RNA序列结合在一起导致原代细胞中的基因高效地失活。这就使得研究人员能够发现参与免疫细胞调节的新基因。

  这仅需一种将Cas9酶带到将被切割的DNA位点上的RNA片段。这种RNA片段被称作单向导RNA(sgRNA),含有长20个碱基(A、U、C或G)的与基因组靶位点互补的序列。在此之前,科学家们不得不通过手工费力地选择或者利用多种在线工具选择sgRNA。在某些情形下,人们并不确定所选的sgRNA是否将Cas9酶携带到基因组上合适的位点或者一种类似的但不是所想要的位点,以及这种sgRNA的效率是否比较高。

  这种新的“CrispRGold”程序使得让特定基因失去功能变得更加简单。它寻找确定的DNA靶序列以便鉴定出进行切割的最佳位点并且提示一种在遗传物质上独特的仅运送Cas9蛋白到所需位点上的sgRNA序列然后能够切割靶基因以至于它不能够发挥功能。这种程序是基于实验数据和这些序列的独特性和其他性质而被开发出来的。

  通过与Van Trung Chu博士合作,来自Rajewsky教授领导的这个团队的博士生Robin Graf在小鼠的B细胞中测试了这个系统。这些细胞不能够在体外培养非常长的时间,这是因为它们不会它们的自然环境外存活较长的时间。因此,基因在很多B细胞中必需尽可能快地失活以便研究它们的功能。Chu通过培养一种产生大量的但是具有良好数量耐受性的Cas9蛋白的转基因小鼠品系而实现这一点。

  研究人员随后从这些小鼠体内分离出B细胞,将单个基因特异性的sgRNA运送到这些细胞中。Graf说,利用CrispRGold程序设计出的sgRNA在平均80%的这些细胞中高重复率地破坏这些靶基因。“在这种类型的低通量实验中,高效率和低错误率是绝对必要的。”

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[来源:生物谷]
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