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重复实验亲历者:对韩春雨新基因编辑技术的几点疑惑

仪器信息网 2016/09/08 14:34:38 点击 597 次
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[导读] 蔡宇伽向澎湃新闻分享了他的实验过程,他表示愿意实名聊聊他的困惑。9月7日,蔡宇伽把韩春雨课题组论文中关于Figure4(图4)的疑惑,邮件给《自然-生物技术》的编辑,等待回应。

  河北科技大学韩春雨在8月8日更新了实验操作细节,来自丹麦奥胡斯大学的蔡宇伽根据新旧版本,两次试图重复实验,然而都以失败告终。

  近日,蔡宇伽向澎湃新闻分享了他的实验过程,他表示愿意实名聊聊他的困惑。9月7日,蔡宇伽把韩春雨课题组论文中关于Figure4(图4)的疑惑,邮件给《自然-生物技术》的编辑,等待回应。

  蔡宇伽是来自中国的丹麦奥胡斯大学博士后,他先后师从Jacob Mikkelsen 和Soren Paludan教授,研究方向是开发基因治疗相关技术,包括病毒载体、基因编辑工具以及利用基因编辑工具研究免疫学问题,曾以第一作者身份在《eLIFE》期刊发表两篇论文。

  NgAgo技术是一门崭新的基因编辑技术,由河北科技大学副教授韩春雨课题组5月2日在《自然-生物技术》上发表。NgAgo是“Natronobacterium gregoryi Argonaute”的简称,也就是来自格氏嗜盐碱杆菌的核酸内切酶。它不同于Argonaute(Ago)家族诸多需要高温的酶,能在37摄氏度常温下进行操作。这使得它能够和当今最为时兴的“基因魔剪”CRISPR-CAS9一起,共同效力于“编辑”目标基因,实现对特定DNA片段的敲除、加入等。论文发表4个多月后,因多个实验室表示无法重复实验,NgAgo技术受到质疑。

  两次尝试重复实验失败,蔡宇伽说,“这是我个人的例子,但是不能证明这个不能重复,还需要更多的人做实验,公开数据。”他还提到:“科学家是有义务去公开数据,让别人去重复。我个人认为,科学是站在别人的肩膀上,同时你也要愿意成为别人肩膀,这样科学才能进步。”

  蔡宇伽第一次重复NgAgo实验,是在韩春雨将实验所需的质粒上传到非营利性质粒共享信息库Addgene后不久,蔡宇伽在一个基因上尝试了NgAgo系统,没有成功。

  第二次,根据韩春雨8月8日上传的新版实验方法,在人类细胞上,蔡宇伽“完整”、“严格”地按照实验方法来做,“我不能保证条件是完全一样的,是按实验室条件最大程度地接近”。在蔡宇伽使用了两种不同的转染方法(Lipofectamine 2000和钙磷法)后,结果是“都没有看到NgAgo有活性,而CRISPR都是有效的。”在科学网的博客上,蔡宇伽分享了自己第二次重复实验时的T7EI结果图。

蔡宇伽第二次尝试重复实验的T7EI结果图。

来源:蔡宇伽博客。

  值得一提的是,蔡宇伽公布的实验结果和相关数据,是为数不多针对韩春雨新版实验方法而做出的。8月17日,日本东京都医学科学研究所(Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science)PI(项目负责人)Yuichiro Miyaoka和澳大利亚科学家盖坦·布尔焦都在个人推特上公布了自己最新的实验结论——无法重复。但Yuichiro Miyaoka和盖坦·布尔焦都告诉澎湃新闻(www.thepaper.cn),他们的结果是根据韩春雨在《自然-生物技术》上的实验操作进行,并非是更新的版本。

  对于实验所需的时间,蔡宇伽说最关键的实验所需要的时间是5天左右。此前,韩春雨曾对质疑声在论文发表后不到一个月就出现表示过疑问,他认为一个月“实验还没做完一轮”。进行过重复实验但未成功的盖坦·布尔焦和德国癌症研究中心的博士生Jan Winter都分别告诉过澎湃新闻(www.thepaper.cn),做完一次完整的NgAgo实验所需的时间。盖坦·布尔焦表示至少需要2-3个月。Jan Winter则表示,就他而言,全职做实验无需耗费一个月时间。澎湃新闻向蔡宇伽询问,为何盖坦·布尔焦所需时间较长,蔡宇伽认为,这是因为盖坦·布尔焦是在受精卵上做实验,要“复杂一点”。

  韩春雨曾表示,80%的NgAgo重复实验失败是因为污染。为了确认自己的实验没有污染,蔡宇伽把自己的细胞送到德国GATC公司检测是否有支原体污染,检测结果显示细胞是干净的。

蔡宇伽把细胞送检德国GATC公司后的结果。

来源:蔡宇伽博客。

  “他新的protocol主要是强调几点:1.EDTA会影响NgAgo的活性。2.镁离子有辅助作用,会帮助NgAgo保持活性。3.保证没有污染。”蔡宇伽解释说,他的重复实验排除了EDTA和支原体污染,但仍不成功,也有可能是有一些其他不确定因素。在科学网的博客上,蔡宇伽分析这些不确定因素包括:“用的是实验室现有的DNAase/RNAase-free的水,不确定PH是多少;也没有荧光标记的ssDNA,不知道gDNA转染效率怎样;也没有来得及用Fragment analyzer看看的gDNA的纯度怎样。”

  蔡宇伽还透露说,重复不出的并不只是自己,“我们那个系,也有人重复了,用他们合成的NgAgo,试了韩的以及除了韩之外的方法,还试了各种方法,比如转染,还把NgAgo做成病毒,感染细胞,但是也没有成功。”

  但蔡宇伽也强调:“谁也没法说这是真是假。我个人是做了重复实验,但是没有重复出来。如果有忽视的地方,也完全有可能。但至少说明,NgAgo没有那么好做。”

  尽管韩春雨本人也多次公开表示,目前的NgAgo尚不稳定,有不完善的地方,但蔡宇伽的困惑是,韩春雨发表在《自然-生物技术》的论文中说,NgAgo和CRISPR-Cas9一样高效。澎湃新闻(www.thepaper.cn)查阅发现,韩春雨论文原文中写道:“NgAgo-gDNA 和Cas9-sgRNA在切割哺乳动物基因组DYRK1A位点的效率上是可以媲美的,NgAgo是31.97%,Cas9是32.2%(原文:NgAgo-gDNA and Cas9-sgRNA cleaved this locus with comparable efficiencies(Fig. 4e, 31.97% for NgAgo vs. 32.2% for Cas9))。”

  “《Nature》的要求比较高,效率越高越好,这可能导致一些研究者做一些夸大。”蔡宇伽说。

  蔡宇伽研读过韩春雨课题组发表在《自然-生物技术》上的论文,他还表达了一些困惑。

  首先是被认为最有难度、也最关键的Figure4(图四),蔡宇伽说“我个人认为,图有点自我矛盾。”他找出电脑中已经下载好的论文,一一指给澎湃新闻:“Fig.4a各靶点之间最大相隔30个核苷酸,T7EI切割,跑胶之后,各产物条带大小一致。而在Fig.4e,Cas9靶点和NgAgo靶点部分重合,相距小于30个核苷酸,但却看到了两者产物条带的明显偏移。另一个奇怪的地方是,Fig.4e里NgAgo两个产物条带分别小于对应的Cas9产物,而在Fig.4f里NgAgo的两个产物条带大小却和对应的Cas9产物一致。”

  “另外一个比较困惑的地方,根据补充材料Supplementary table 2,GATA4基因的PCR扩增产物应该是705bp,而在fig.4f却是稍大于750bp。” 蔡宇伽补充道。

  9月7日,蔡宇伽已把关于Figure4的疑惑邮件给《自然-生物技术》的编辑,等待回应。

韩春雨课题组论文中的Figure4。

来源:韩春雨课题组论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》。

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[来源:澎湃新闻网]
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