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重组蛋白表征——肽图分析
2018/08/02 15:51
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方案摘要：
产品配置单：
Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统
型号： 1290 Infinity II
产地： 德国
品牌： 安捷伦
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Agilent 1290 Infinity II Multisampler
型号： 1290 Infinity II Multisampler
产地： 德国
品牌： 安捷伦
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方案详情：
肽图分析是蛋白质鉴定，特别是重组蛋白鉴定的最常用的方法。它通过酶解（一般使用胰蛋白酶）将蛋白质打碎形成肽段，然后以可重现的方式进行肽段的分离和鉴定。肽图分析是一种非常有用的方法，已成为生物技术领域中最有价值的工具之一，它能检测和监控单个氨基酸改变、氧化、去酰胺化，以及其它降解形式。它还能直接检测常见的单克隆抗体修饰变异，如N 端环化，C 端赖氨酸处理，N-糖基化，以及内含子表达等非预期的变异。
肽图是蛋白质及其酶解产物的指纹图谱，它能提供待测蛋白质的全面信息。肽图分析包含四个主要步骤，蛋白质的分离和纯化；肽键的选择性酶切；多肽的色谱分离；多肽的分析和鉴定。对测试样品与参考标准品或对照样品进行同步的酶解和分析。肽图应该包括足够数量的肽段以进行有效的分析；它不仅要提供蛋白质鉴定所需的必要信息，还应尽可能地涵盖完整的蛋白质序列。
利用反相液相色谱/ 质谱进行酶解肽段混合物的分离检测已经成为鉴定重组蛋白的首选方法和产品出厂的必行检测。蛋白质生物制剂的稳定性也是表征的一个重要方面，需要在通常的储存条件下进行长时间的监测，研究保质期内产品可能发生的变化如氧化、还原、糖基化和截短等。
因为常规的液相色谱与质谱很容易联用而且能得到很好的二级质谱用于蛋白质鉴定，所以很多多肽的分析都是在电喷雾(ESI) 液质联用系统上完成的。Q-TOF 具有高分辨率和高质量精度的优点，能提供更多的结构信息，尤其是对于较大的肽段。分析级和毛细管级的液相色谱系统和色谱柱常常被用于肽图分析。在样品量有限的情况下以及对于单克隆抗体的亚单位或更小的重组蛋白的分析，安捷伦基于微流控芯片的LC/QTOF 质谱系统能快速提供高度准确的肽图，而且样品量消耗极少。这对于微量杂质或组分的分析是非常有价值的。
蛋白质及其可能的修饰变异体可以从肽图数据中得到鉴定，方法是先用分子特征提取软件确定每个肽段的真实质量数，然后确定其结构。软件还可以根据已知的蛋白质序列生成一个理论的酶解肽段列表。将实验数据与理论肽段进行比较可以确认蛋白质。肽图可能包含超过60 个独立肽段及其衍生物的峰，因此需要强大的分离方法。表面多孔的反相颗粒技术采用合适的填料孔径，可以极大提高了分离效率和速度，能实现单克隆抗体中轻链和重链100% 的序列覆盖率，同时相比传统填料分析时间缩短了一半。全多孔反相色谱颗粒还能生成高覆盖率的肽图，通常使用小粒径的长柱子及超高压液相色谱，如安捷伦1290 超高压液相色谱系统。
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