药物疫苗中蛋白检测的TN分析法

背景介绍

在药物疫苗生产中，需要对起始、中间和最终产品的抗原水平进行控制。用以检测衰减或失活的病毒或细菌数量。由于这些抗原通常由蛋白质组成，总蛋白的分析定量是一种可选方法。

《药典》规定了许多相关方法，其中包括几种紫外/可见分光光度法（如Lowry法、Bradford法、BCA法）以及两种总氮法，即凯氏定氮法和催化燃烧法。本应用说明重点介绍了欧洲药典Pharm. Eur. 2.5.33, Method 7 B催化燃烧法：氮化合物在氧气中高温裂解为一氧化氮（NO），然后通过化学发光检测器（CLD）进行检测。此方法描述几乎与EN 12260一致，后者描述了环境水中TNb的测定。 multi N/C分析仪既是如此设计，因此也可用于医药产品中TNb的测定。TNb可以转化为总蛋白来确定其抗原的水平。

由于蛋白质的含氮量不同，根据以下公式乘以系数6.25，将总氮浓度转换为总蛋白质浓度已被广泛接受：

C [总蛋白] = c [TN] x 6.25  

仪器

表1： 分析仪说明：multi N/C 2100S

样品和试剂

在客户现场制备的5个尿素TNb校准标准、1个BSA对照标准品和3个未知的客户样品，测定三次。分析前，样品在4℃下制冷剂中保存。

恢复至室温室后，用微量移液管将液体样品直接转移到2毫升样品瓶中，并盖上瓶盖。由自动进样器取样75μL样品直接注射进燃烧炉中。在铂催化剂的作用下，所有氮化合物在纯氧环境中通过高温燃烧催化转化为一氧化氮（NO），随后由化学发光检测器（CLD）定量检测NO。

测样顺序、自动搅拌及洗针设置均由AS60自动进样器控制完成。

校正

采用BSA蛋白质标准溶液配置5 – 60 mg/L系列总氮（TNb）多点校准标样。200mg TN/L BSA储备溶液（Sigma Art.Nr. A-7906，白蛋白，牛氮含量为15.60%，纯度为98%），称重128.2mg，用超纯水定容至100mL。此类样品中从测定的氮含量计算蛋白质浓度的标准转换因子（在文献中找到）为6.25。

图1：TN示例 – BSA校正曲线和特征范围5-60mg/L N

结果和讨论

每个样品至少测定三次。

表3： 方法设置

结论

所有样品都得到了很好的重复性，RSD值很低。

采用微量注射器进样，从样品瓶到燃烧炉的距离短，直接注射无传输管路和阀门。样品消耗量极少，3次润洗，5次75μL重复测试，样品消耗总体积不超过1.5mL。

配置CLD检测器的multi N/C分析仪是进行总氮测定的分析系统，遵循Pharma Eur. 2.5.22 method 7 B。客户的校准标准品和检查标准（BSA）的回收率佳，样品峰型多次测量均无偏移重复性好，且无拖尾，充分证明了仪器性能。