注射液中脱氧核苷酸钠检测方案(离子色谱仪)

样品前处理 结论 引言 脱氧核苷酸钠是一种具有遗传特性的化学物质，其在个体的生长、繁殖、遗传、变异等生理生化功能方面起着非常重要的作用。目前常用注射用脱氧核苷酸是用脱氧核糖核酸(DNA)为原料，经生物酶催化水解反应生成脱氧腺苷酸(dAMP)，脱氧鸟苷酸(dGMP)、脱氧胞苷酸(dCMP)和脱氧胸苷酸(TMP)等四种脱氧核苷酸，然后经层析分离获得高纯度四种单一脱氧核苷酸产品。医药常使用复方制剂，组分包含脱氧糖胞嘧啶核苷酸、脱氧核糖腺嘌呤核苷酸、脱氧核糖胸腺嘧啶核苷酸及脱氧核糖鸟嘌呤核苷酸钠盐。用于急、慢性肝炎，白细胞减少症，血小板减少症及再生障碍性贫血等的辅助治疗。 对于脱氧核苷酸的检测，现有药典方法推荐使用Whatmen Partisil-5 SAX色谱柱分离，分离效果较差，且硅胶基离子交换柱使用寿命短。本文则着重研究了高分子聚合物机制的DNAPac 系列阴离交交换色谱柱用于脱氧核苷酸的分离2，并将之应用于多种不同品质的注射用脱氧核苷酸钠制品的测试。 测试条件 仪器： ICS3000多功能离子色谱仪包含：四元梯度泵，1DC模块，VWD3400， AS自动进样器 色谱柱：DNAPac PA100， 13 um， 4mm×250mm(P/N：043010)， DNAPac PA100G， 13pm，4mmx50mm(P/N： 043018) 柱温：20℃；流速：1.50mL/min；进样方式：自动进样；定量环：10pL； 淋洗液：A，超纯水； B， 17mmol/L磷酸钠/ 50mmol/L 氢氧化钠； C， 270mmol/L高氯酸钠； D， 100mmol/L高氯酸钠； 梯度淋洗表参见下表： 表1.梯度淋洗液表 时间 (min) A B C D 0 96 4 0 0 6 96 4 0 0 6.01 86 14 0 0 15 72 14 0 14 19 16 14 0 70 19.01 6 14 80 0 19.50 6 14 80 0 19.51 96 4 0 0 25 96 4 0 0 检测方式：紫外检测，波长：260mm。 注射用脱氧核苷酸钠50mg先以2mL超纯水溶解，并稀释至200mg/L，直接进样。注射液直接用超纯水稀释至200mg/L，直接进样。 结果和讨论 色谱条件的选择 比较了DNAPac PA100和200对于此类样品的适用能力，相对比防线，PA100色谱柱对相对保留较弱的dCMP和dAMP具有更好的分离效果，而在PA200上则非常难分开这两个主成分后的杂质峰。通过梯度条件的不断改进，最终可保证四种主成分与四个主要杂质，小分子碱基和聚核苷酸的良好分离，色谱柱见图1。且峰形尖锐，柱效高，以组分复杂的脱氧核苷酸注射液为例，选择4个主峰及4个主杂质峰(每个主峰后对应一个峰)为研究对象，其相应分离度和峰数据如下表2。 Peakname Resol.(EP) Asym.(EP) Plates(EP) dCMP 1.98 0.91 6587 A 2.28 0.94 7701 dAMP 2.40 0.83 9480 B 20.41 1.09 5593 dTMP 4.07 1.15 43500 C 7.18 0.92 38529 dGMP 7.53 0.93 33069 D 7.23 0.92 59617 标准曲线和方法检出限 dCMP、dAMP、dTMP和dGMP在0.5-500mg/L浓度范围内都具有良好的线性，标准曲线拟合方程见表3所示，相关系数在0.99991~0.99998。根据3倍信噪比(Signal/Noise=3)可分别计算出四种待测组分的检出限分别为0.3，0.2，0.2和0.1mg/L。 方法重现性、回收率及样品测试结果 以注射用脱氧核苷酸钠为研究对象，连续十针进样，重现良好，保留时间的RSD小于1%，而峰高和峰面积则RSD在1~2%之间。样品经处理后直接进样分析，图2为某纯度较差注射液样品及加标谱图对比，加标回收率在101.9~104.8%之间(参见表4)，表明样品基体组分对脱氧核苷酸测定不存在明显影响。 (1，注射液样品；2，加标150mg/L混标) 表3.标准工作曲线的线性范围、相关系数和检测限 待测物 标准拟合方程 线性范围(mg/L) 相关系数(r) 检测限/(mg/L) dCMP v=0.0285x-0.0123 0.5-500 0.99991 0.3 dAMP v=0.0632x-0.0353 0.5-500 0.99991 0.2 dTMP y=0.0286x+0.0056 0.5-500 0.99996 0.2 dGMP v=0.0688x-0.0291 0.5-500 0.99998 0.1 表4.部分样品测定结果及加标回收率 待测组分 样品测得值(mg/L) 加标量(mg/L) 加标测得值(mg/L) 回收率 dCMP 223.07 150.00 377.48 102.9% dAMP 227.58 150.00 380.42 101.9% dTMP 177.79 150.00 334.97 104.8% dGMP 96.67 150.00 252.81 104.1% 采用DNAPac PA100高效阴离子交换核酸分离柱，在梯度淋洗条件下可实现C、A、T、G四种脱氧核苷酸与常见4种主要杂质(怀疑为C、A、T、G四种核苷酸)的良好分离，分离度可达到1.5以上，峰形对称度在0.83-1.15之间，而理论塔板数均能高于5000。此外，方法还具有常规柱无法比拟的优势，能同时分离小分子碱基，单分子核苷酸还有聚核苷酸，参见谱图中3min以前的峰和16min以后的出峰。离子色谱柱上得到的峰形相比传统液相柱得到的更为尖锐，因此灵敏度相对更高，10uL进样时即可达到0.5mg/L以下的检出限。 比较了不同波长对于待测物质的灵敏度，结果发现在260-270区间内四种待测组分灵敏度各有高低，但相差不大，因此最终确认260-270nm作为可选检测波长范围。 此次条件摸索实验中，共累计进样近200针，并未出现常规液相柱出现的柱效明显下降的问题，表明DNAPac色谱柱对于样品耐受能力要更强。样品中若含有多糖等其它辅料，可能需要经过超滤等前处理步骤处理样品后方可进样分析，以免辅料污染色谱柱。 ( [1]程速远，郝苏丽，杨化新.脱氧核苷酸钠含量测定方法的探讨.中国药品标准，2008，9(5)：368-369 ) ( [2] Application Note 1 62， D etermination o f Nucleotides by lon Chromatography with UV Absorbance Detection ) 免费服务热线：800810 5118 ThermoFisherS GIENTIFIC 支持手机用户)