蛋白质中蛋白质定量检测方案(液质联用仪)

实验方法 数据处理 Q Exactive 系列仪器中 TMT定量工作流程的仪器参数优化和 Proteome Discoverer 2.1软件数据处理方法 Xiaoyue Jiang1， Tabiwang Arrey?， Eugen Damoc?， Michaela Scigelova²， David Horn1， Rosa Viner，andAndreas F.R. Huhmer1 1Thermo Fisher Scientific， San Jose， CA， USA； 2Thermo Fisher Scientific， Bremen， Germany 关键词 QExactive Plus， QExactive HF， TMT， Proteome Discoverer 2.1，蛋白质鉴定，相对定量，同量异序标签，多重定量 在 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 仪器平台上，采用 ThermoScientificTM TMTsixplexTM 和 TMT10plexTM 工作流程，建立最优的质谱数据采集方法将其应用于蛋白质的相对定量研究中。本文详细介绍了该工作流程所涉及的样品前处理、肽段分离和质谱分析等过程，以及采用 Thermo ScientificTM|ProteomeDiscovererTM 软件2.1版本对数据进行处理和分析的具体流程。 同量异序标签(如 Tandem Mass 标签TM (TMTTM) 1 或 isobaricTag for Relative and Absolute Quantification (iTRAQ@)2)是基于质谱技术的蛋白质相对定量方法中非常常见的一种。3-6其中，基于 TMT 标签的多重相对定量方法具有很多优势，包括整个实验周期更短、波动更小，样品通量更高，以及样品间定量数据的缺失更少等。标记氨基的 TMT10plex 与 TMTsixplex 反应试剂的化学结构相同但是前者在质量报告区域中可以提供更多的13C和15N同位素组合形式。对于某些组合间彼此仅相差一个中子的质量，需要高分辨率的分析仪器实现串联质谱谱图采集才能进行区分。 Thermo ScientificTM TribridTM 质谱仪家族， 包括 OrbitrapTMFusionTM MS 和 Orbitrap Fusion LumosTM MS 仪器，所提供的同步母离子选择(SPS) MS3 方法能够在具有高动态范围的复杂样品中实现最为准确的 TMT定量分析。7，8 而 ThermoScientificTM Q ExactiveTM 质谱仪系列仪器，结合了四极杆对母离子选择的高选择性和高特异性特 Orbitrap 质量分析器的高分辨率和准确质量(HRAM) 检测能力的优势，也是进行同量异 序定量分析的一把好手。 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus质谱仪通过配备改进的四极杆技术(AQT)以优化离子选择能力和传输效果，同时提高了在窄小的隔离窗口内对低丰度离子进行定量分析的能力。9 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF质谱仪引入了超高场 Orbitrap 质量分析器，能够以两倍于QExactive Plus MS 的扫描速度实现高分辨率检测，表现出了更为优异的性能。9 基于 Q Exactive 质谱仪的 TMT 标记定量分析流程，不仅能够实现肽段和蛋白质鉴定结果的最大化，而且能够同时为多达十个不同样品提供高定量准确度的相对定量结果。该流程的前提是需要良好的色谱分离效果、充分分辨的质谱峰、足够的离子丰度，以及能以高扫描速度采集高质量的 MS2碎裂谱图。本应用文档为 TMT 标记及其相对定量策略提供了详细的分步指导，包含样品前处理、仪器设置，以及采用 ThermoScientificTM Proteome DiscovererTM 2.1软件对多重定量数据进行处理和分析。本文详细讨论了关键仪器参数(分辨能力、最大注入时间、自动增益目标值、碰撞能量和隔离窗口等)对蛋白质和肽段鉴定以及定量结果的影响，以保证用户能够参照本文成功地在 Q Exactive 系列质谱仪上建立 TMT 定量工作流程。 TMT标记 采用 Thermo Scientific TMT 试剂对 E. coli 酶解产物标准样品(Waters@ Corp， Milford， MA)按如下步骤进行标记： 1.将三乙胺碳酸盐(TEAB) 缓冲液、TMT 标签和干粉状态下的样品从-20℃转移至室温下平衡。 ( 2.将 500 pL溶解缓冲液 (Dissolution Buffer， 1 M TEA B )加 入到4.5mL超纯水中，制备100 mM TEAB 溶液。 ) ( 3.将单个样品(不超过 10 0 pg/TMT 标签) 溶于100mM TEAB 缓冲液， 得到 1 pg/uL 的样品溶液，充分涡旋振荡， 放置10分钟。 ) 4. 在每个 TMT 试剂瓶中加入41 pL 新鲜 LC-MS级乙腈，充分涡旋振荡，放置10分钟。 5.在每个 TMT 试剂瓶中加入不高于 100 uL 第3步中制备的样品溶液，涡旋振荡，孵育1小时。 6.反应1小时后，向每个小瓶中加入8pL5%羟胺(将试剂盒中提供的50%羟胺储备液用水稀释10倍)以终止反应，孵育15分钟。 7.标记结束后，立即按所需比例混合不同样品。在本研究中， TMTsixplex 试剂(通道126-131)的混合比例为20：10：1：1：10：20。所选六种TMT10plex 试剂(通道127C， 128N， 128C，129N， 129C， 130N)以相同比例混合。 8.将制备好的样品分成小份，干燥，在-80℃下储存。 9.进行 LC-MS分析前将制备好的 TMT-标记样品重悬于 0.1%TFA/5% ACN (v：v)溶剂中；重悬好的TMT-标记样品能够在4℃稳定保存一周，避免反复冻融。 为考察定量分析的准确度， 将 Thermo ScientificM PierceTM HeLa蛋白酶解产物标准样品(P/N 88328)按上述流程进行标记，将TMTsixplex 通道 129-131 和 TMT10plex 通道 127N、127C 和128N分别以 10：10：10比例混合，然后加入 E. coli 样品中，每通道比例为 1：1 (33 ug HeLa 酶解产物+67 ug E. coli 酶解产物)。 色谱分离条件设置详见表1。进样量相当于1 pg 起始蛋白质。 参数 设置 LC Thermo ScientificTM EASY-nLCTM 1000 流动相 A： 0.1%甲酸水溶液；B：0.1%甲酸乙腈溶液(Fisher Chemical) 洗脱梯度 0-100 min 7-25%B；100-120min 25-60%B； 121 min 95%B， 保持95%5 min 流速 300 nL/min 捕集柱 Thermo ScientificTM AcclaimTM PepMapTM 100C18 LC 柱， 75 um x2 cm， Thermo ScientificTMDionexTM nanoViperTM， C18， 3 pm， 100A ( P/N164705) 分离柱 Thermo ScientificTM EASY-SprayTM C18 LC柱， 75um x 50 cm， 2 um， 100A (P/NES803) 通过液相色谱洗脱得到的肽段分别由 Q Exactive Plus 和QExactive HF 质谱仪在数据依赖采集模式下进行分析。仪器参数设置参见表2。 表2.采用Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 仪器分析 TMTsixplex 和TMT10plex标记样品的推荐仪器参数设置 Q Exactive Plus Q Exactive HF 全扫 MS 参数 分辨能力(m/z200处的 FWHM) 70，000 120，000 自动增益目标值( AGC) 3e6 3e6 最大注入时间(ms) 50 50 扫描范围(m/z) 375-1400 375-1400 MS2参数 分辨能力(m/z200处的 FWHM) 35，000 30，000(TMTsixplex )60，000 (TMT10plex) 自动增益目标值 (AGC) 1e5 1e5 最大注入时间(ms ) 100 100 隔离窗口(Th) 0.7或1.2 0.7或1.2 归一碰撞能量(NCE) 32 32 环数(Loopcount ) 10 或 15 10或 15 起始质荷比( Firstfixed mass) 100 100 最小填充比 ( Underfill ratio) 2% 2% 电荷数识别(Charge staterecognition) 2-7 2-7 肽段匹配( Peptidematch) 优选 优选 动态排除(Dynamicexclusion(s)) 30 30 采用 Proteome Discoverer 软件2.1版本(PD2.1)进行数据处理。该软件的特色是提供了全新改进版的 TMT 定量分析工作流程，其新功能包括：1)可用于添加报告离子同位素分布的全新用户界面；2)解析TMT10plex

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